Genom boyu taramaları ve moleküler genetik yaklaşımlarıyla Escherichia coli bakterisinde bor toleransı ile ilgili genlerin araştırılması
Investigation of genes related to boron tolerance in Escherichia coli using genome-wide screening and molecular genetic approaches
- Tez No: 543993
- Danışmanlar: DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biology, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 252
Özet
Bakterilerin çevrelerindeki değişikliklere adaptasyonları, taşıdıkları genler, proteinler ve metabolitleri içeren geniş ve karmaşık düzenleyici bir ağ üzerinden, moleküler düzeyde kontrol edilmektedir. Bu düzenleyici ağın dinamiklerini anlamak, biyolojinin temel amaçlarından biridir. Bu etkileşimleri tanımlamak ve karakterize etmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Son yıllarda hızla artan genomik, proteomik ve transkriptomik alanlarında gerçekleşen gelişmeler, genotipik ve/veya çevresel değişikliklerin neden olduğu küresel metabolik değişiklikleri anlamada birçok fonksiyonel genomik temelli yaklaşımın kullanılmasına izin vermiştir. Günümüzde bakteriler ve“omik”teknolojilerin birlikte kullanımı, hücresel sistemleri anlamada en makul, hızlı ve etkili yollardan biridir. Bor elementi ülkemiz için çok önemli bir ekonomik ve stratejik değere sahiptir. Bu element, birçok sektörde kullanılmakta ve her geçen gün önemi gittikçe artmaktadır. Türkiye'nin dünya bor rezervlerinin büyük çoğunluğuna sahip olmasından dolayı Bor üzerinde yapılan çalışmaları bizim açımızdan daha da değerli kılmaktadır. Bor'un ekonomik potansiyelinin yanı sıra, biyolojik olarak da önemi söz konusudur. Bitkiler ve diğer bazı canlı grupları için esansiyel bir mikro-besin elementi olduğu bilinmektedir. Az miktarda vazgeçilmez iken, belli bir seviyenin üzerinde toksik etkilere sahiptir. Bor elementi, birçok açıdan irdelenmesi ve araştırılması gereken bir yarı metaldir. Hücrede bor ile ilişkili biyomoleküller yeterince aydınlatılmamıştır. Hücresel sistemlerde ve canlılarda Bor ve periferindeki moleküller ve mekanizmalar araştırılmalıdır. Bu tez çalışmasında bakterilerde bor toleransı ile ilgili olan genlerin ve buna bağlı olarak mekanizmaların aydınlatılması için bilgilerin elde edilmesi amaçlamıştır. Gen fonksiyonu bulmada geçmişten beri, mikrobiyal genetik çalışmalarında, önce hedef genlerin nakavt edilmesi ve sonra hipotez odaklı birçok aday fenotipin mutant üzerinde test edilmesi yaklaşımı esastır. Araştırılan gen açısından mutant hücre oluşturulduktan sonra, yabanıl tip ile arasındaki fenotip farklılıklar araştırılmaktadır. Ancak son yıllarda, genomik bilimlerin daha da gelişmesiyle ve mutant hat ve koleksiyonlarının oluşturulmasıyla bu trend kısmen değişmiş ve daha da etkili bir yöntemle birçok gen-fenotip bağlantısının kurulmasına yol açmıştır. Artık bir gen için birçok fenotipin denenmesi değil, aksine bir fenotip için binlerce genin test edilmesi söz konusudur. İşte bu tez çalışması, bir model bakteride yaklaşık 4000 adet genin, bor toleransı veya duyarlılığı fenotipi ile bağlantısını araştırmak için kurgulanmıştır. Bunun için Escherichia coli'ye ait genlerin tekli mutantlarını içeren, KEIO koleksiyonu kullanılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında, genom boyunca tarama çalışmaları yapılmıştır. Bu aşamada, 3985 adet mutant suş, farklı borik asit konsantrasyonu içeren besi yerlerinde taranmıştır. Buradaki hedef, yabanıl tip E. coli suşuna kıyasla, borik asite karşı daha duyarlı olan mutantların tespit edilmesidir. Yabanıl tipin yaşayabildiği konsantrasyondan daha düşük seviyedeki bir konsantrasyonda yaşayamayan mutant bora duyarlı mutant olup, doğrudan veya dolaylı olarak, bor toleransı ile ilişkilidir. Genom boyunca tarama çalışmaları sonucunda binlerce mutant arasından duyarlı olanlar belirlenmiştir. Bu mutantlar birkaç farklı teknik ile onayladıktan sonra, mutantların duyarlılık veya direnç seviyeleri teyit edilmiştir. Daha sonra, bor duyarlılığın, söz konusu mutanttaki nakavt edilen genden kaynaklandığını ispatlamak için, hedef gen plasmit vektör ile transformasyon yardımı ile mutant E. coli hücresine gönderilerek, komplementasyon deneyleri yapılmıştır. Bu çalışmalar hem LB besiyeri hem de M9 minimal (%0,4 glikoz) ve M9 minimal (%0,4 gliserol) besiyerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu aşamalardan sonra, tekli mutantlardan uygun olanlarının bir araya getirilerek, bor toleransı çok daha düşük, ikili veya üçlü mutantlar, ya da“süper mutantlar”oluşturulmuştur. Bu tez çalışmasının bir diğer bölümünde de, daha önceki çalışmalarımızda bor madenlerinden izole edilmiş olan ve tolerans seviyesi 200-300 mM borik asit gibi, normalde hiçbir canlının yaşayamayacağı ekstrem ortamda yaşayabilen bakterilerin genomik kütüphaneleri kullanılarak deneyler yapılmıştır. Çalışmanın bu aşamasında, bu izolatlara ait genomik kütüphanelerden plazmidler izole edilerek, yukarıdaki süper mutanta transform edilmiş ve komplemantasyon deneyleri yapılmıştır. Böylece, madenden elde edilen bakterilerin içindeki Bor (tolerans) geni, bu sistem ve tespit edilen mutant marifetiyle tespit edilmiştir. Ayrıca BW25113 E.coli bakteri suşunun genomik kütüphanesi oluşturulmuştur. Oluşturulan genomik kütüphane borik asit ile seleksiyondan geçirilerek, E.coli bakterisinin bor ile ilgili genlerinin bu yöntem ile de belirlenmesi hedeflenmiştir. Tez çalışmasının son aşamasında, proteomik teknolojisi kullanılmıştır. Böylece söz konusu konuya iki açıdan da, hem genomik hem de proteomik perspektifinden yaklaşılmıştır. Burada E. coli, üç farklı bor konsantrasyonu içeren besi yerinde yetiştirilmiş ve hücre membranında yer alan, bor tarafından indüklenen veya baskılanan bazı genler ve proteinler 2D jel elektroforez ve Maldi-TOF analizleri sonucunda açığa çıkarılmıştır. Yapılan tüm çalışmalar sonucunda, bor ile ilgisi olduğu düşünülen genler listelenmiştir. Genom boyunca tarama çalışmalarında, LB zengin besiyeri ortamında yapılan tarama çalışmalarında tespit edilen genler aceF, torR, dinJ, trmU, cheZ, ylaC, yoaC, yohN, aroK, glxK, yfeS, ygaV, galS, trpR, talB, garP, nohA ve yddE genleridir. M9 minimal besiyeri kullanılarak yapılan tarama sonuçlarında tespit edilen genler ise mdtL, yedA, ygaZ, ycdO, mdtI, dcuC genleridir. Ayrıca, farklı bir yaklaşım olan outer membran proteomik çalşmaları ile Sdha, Tnaa, Tuf1, Atpd, Ompt, Pvkf proteinlerinin bor'a karşı tolerans ile ilişkili olabileceği not edilmiştir. Bunun yanı sıra daha önceki çalışmalarımızda bor madenlerinden izole edilen izolatların genomik kütüphaneleri üçlü (triple) mutantlar içerisine transforme edilerek, bu izolatların yüksek bor konsantrasyonuna tolerans sağlamada görevli olabilecek genleri hakkında bilgiler edinilmiştir. Bu genlerin“Na+/H+ antiporter subunit A”,“flagellar hook-associated protein FlgL”,“rhodanese-like domain-containing protein”,“O-methyltransferase”,“formate/nitrite transporter family protein”,“LemA family protein”, aktivitelerine sahip genler oldukları görülmüştür. Bu tez çalışması, moleküler genetik, mikrobiyoloji, genomik, proteomik ve kısmen biyoinformatik alanların bazı bilgi birikimlerini kullanan ve bor (tolerans)-bakteri ilişkisine multidisipliner yaklaşarak, model bakteride yeni, önemli ve yararlı gen bilgileri sunan bir tez çalışmasıdır.
Özet (Çeviri)
Bacteria's adaptation to the changes in their environment is controlled at the molecular level through a large and complex regulatory network of genes, proteins and metabolites. Understanding the dynamics of this regulatory network is one of the main objectives of biology. Different methods can be utilized to identify and characterize these interactions. Genomics, proteomics and transcriptomics have increasingly and rapidly allowed in recent years the use of many functional genomic-based approaches to decipher global metabolic changes caused by genotypic and/or environmental changes. Today, using the bacteria as models and“omic”technologies is one of the most reasonable, fast and effective ways to understand cellular systems. Boron element has a very important economic and strategic value for our country. This element is used in many sectors, and its importance is increasing day by day. Turkey has the majority of the world's boron reserves, therefore the studies on boron makes it even more valuable for us. In addition to the economic potential of the boron, it is known to be an essential micro-nutrient element for some biological systems including plants and some other living groups. While a small amount is necessary and beneficial, it has toxic effects above a certain level. Boron element is a semi-metal that needs to be investigated in many aspects. The biomolecules associated with boron in the cell are not yet sufficiently elucidated. Boron and peripheral molecules and mechanisms in cellular systems and living things should be further analyzed. In this thesis, it is aimed to shed light onto this topic by finding some genes related to boron tolerance mechanisms in bacteria. In gene function studies, the first approach in microbial genetic studies from the past, has been to knock out target genes and then test several candidate phenotypes on the mutant with a focus on the particular hypothesis. The phenotype differences between the wild type and mutant cell are scrutinized and analyzed. In recent years, however, with the further development of genomics and the creation of mutant lines and collections, this trend has changed in part and has led to the establishment of many gene-phenotype relationships in a more effective way. Instead of testing for many phenotypes for a single gene, thousands of genes can be and are tested for a specific phenotype. This thesis study isdesigned to investigate the link between approximately 4000 genes and boron tolerance or sensitivity phenotype in a model bacterium. For this, the KEIO collection, which contains single mutants of the non-essential genes of Escherichia coli, was used. In the first phase of the study, genome wide screening studies were carried out. At this stage, 3985 mutants were screened in the medium containing different boric acid concentrations. The mutants that are more sensitive than the wild-type E. coli were seeked. The assumption is that if a mutant is a boron-sensitive mutant that is unable to live at a concentration lower than the concentration that the wild type can live in, and then the particular gene is related to boron tolerance. As a result of genome wide screening studies, sensitive mutants were identified among the thousands of mutants. After confirming the tolerance levels of these mutants with several different techniques, complementation experiments were performed to check if the phenotype really was really due to the mutated gene or not. For this reason, the target gene in a plasmid was transformed into the corresponding mutant. The studies were performed using both LB medium and M9 minimal (0,4% glucose) and M9 minimal (0,4% glycerol) media. After these steps, some single mutants were chosen and combined to create double or triple mutants, whose boron tolerance levels were much lower. In the other part of this thesis, the experiments were conducted with the genomic libraries of the bacteria that were isolated in our previous studies from the boron mines and are tolerant to 200-300 mM boric acid, which are extreme conditions. At this stage of the study, the plasmids were isolated from the genomic libraries belonging to these isolates and the complementation experiments were performed by transforming them into the above super-mutant. Thus, the boron (tolerance) gene in the mine bacteria was hunted by this system and the triple mutant. The genomic library of the BW25113 E.coli bacterial strain was also constructed in this study. The genomic library subject to boric acid selection resulted in identification of some boron-related genes of E. coli. In the final stage of the thesis study, proteomics technology was used. Thus, the subject is investigated using both the genomic and proteomic perspectives. Here, E. coli was grown and treated with the media containing three different boron concentrations. As a result of 2D gel electrophoresis analysis of the outer membrane protein extracts and following Maldi-TOF analyzes, some proteins in the cell membrane induced or repressed by boron were identified. As a result of all studies, the genes that are related to boron tolerance were proposed using genome screening studies in LB medium containing different levels of boric acid and these genes include aceF, torR, dinJ, trmU, cheZ, ylaC, yoaC, yohN, aroK, glxK, yfeS, ygaV, galS, trpR, talB, garP, nohA and yddE. The genes detected in the screening studies using the M9 minimal media are mdtL, yedA, ygaZ, ycdO, mdtI, dcuC genes. In addition, it was observed that SdhA, TnaA, Tuf1, AtpD, OmpT, PvkF proteins were found as a result of the proteomics approach. In addition to this, in previous studies, the genomic libraries of the isolates isolated from the boron mines have been transformed into the triple mutants and the gene activities of these isolates that may be responsible for tolerating high boron concentration were proposed including“Na+/H+ antiporter subunit A”,“flagellar hook-associated protein FlgL protein”,“domain rhodanese-like domain-containing protein”, protein“O-methyltransferase”,“formate/nitrite transporter family protein H”,“LemA family protein”. In conclusion, this thesis study has utilized the multi discipliner knowledge and some approaches from the fields of molecular genetics, microbiology, genomics, proteomics and partially bioinformatics and presents novel, significant and useful gene information in the model bacteria in order to further shed light onto the relationship between bor and life.
Benzer Tezler
- Kolesteatomlu hastalarda genomik instabilitenin araştırılması
Investigation of genomic instability in cholestetaoma patients
ZEYNEP BETÜL BULUT
- Akciğer kanseri hücre hatlarında ALX3 geninin ifade ve promotor bölgesinin metilasyon düzeyinin araştırılması
Investigation of the expression of the ALX3 gene and the metilation level of the promotor region in lung cancer cell lines
ELİF BEYZA KARTALOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
GenetikBursa Uludağ ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF UZ YILDIRIM
- Bor içeren yeni bir antibiyotik epetraborole (AN3365)'e karşı duyarlı olan escherichia coli mutantlarının Keıo koleksiyonunun taranması ile belirlenmesi
Determination of escherichia coli mutants sensitive to a novel boron containing antibiotic epetraborole (AN3365) by screening Keio collection
ANARA BABAYEVA
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyolojiMuğla Sıtkı Koçman ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
- Kalıtsal duyma kayıplarına neden olan genlerin; haritalama, kritik bölge analizi ve mutasyon tarama yöntemleri ile saptanması
Identification of genes causing hereditary hearing loss by gene mapping, linkage analysis and mutation screening
ABDULLAH ÜZÜMCÜ
- SNP mikroarray yöntemi ile kalıtsal metabolik hastalıklardan sorumlu genlerin tanımlanması
Identification of disease-causing genes in inherited metabolic diseases by SNP microarray method
MERVE EKŞİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
GenetikAnkara Yıldırım Beyazıt ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ DİDEM YÜCEL YILMAZ