The role of glutathione-s-transferase in epithelial mesenchymal transition (EMT) model in colorectal cancer and the enhancement of adjuvant therapy by targeting glutathione-S-transferase inhibitor
Kolorektal kanserde epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) modellemesinde glutatyon-S-transferaz'in rolü ve glutatyon-S-transferaz inhibitörü hedeflenerek adjuvan terapi etkinliğinin arttırılması
- Tez No: 544098
- Danışmanlar: PROF. DR. ALPER BEKTAŞ İSKİT
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Eczacılık ve Farmakoloji, Biochemistry, Biotechnology, Pharmacy and Pharmacology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 167
Özet
Kolorektal kanser, dünya çapında kanserle ilişkili ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. Uzak bölgelere yayılmayan kolorektal kanserler için, cerrahi genellikle birincil veya ilk tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, kemoterapi (neoadjuvan, adjuvan ve ileri evre kemoterapi) halen yaygın olarak kullanılmaktadır. Kolorektal kanseri tedavi etmek için birkaç antikanser ajanı mevcuttur, ancak nihayetinde kanser nüksleri meydana gelir. Mevcut tedavilerin başarısında önemli bir engel, kanser hücrelerinin, genellikle geri dönüşü olmayan bir nokta olarak kabul edilen ve en kötü sonuçla ilişkili olan metastazlara neden olan tekrarlayan adaptasyonudur. Bu nedenle, kanser hücrelerinin direncini arttıran mekanizmaları anlamak, özel bir önem taşımaktadır. Son yıllarda, epitelyal mezenkimal geçişin (EMT), doğal olarak meydana gelen transdiferansasyon programı, kemoterapiye karşı dirençte önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. EMT'nin kemoterapi direncinde ve metastazda kritik bir rol oynadığı yaygın olarak gösterilse de, EMT ile ilaç direnci arasındaki potansiyel sinyalizasyon ağı hala belirsizdir. Glutatyonun (GSH) hem endojen hem de ksenobiyotik kökenli elektrofillerle reaksiyonunu katalize eden bir izozimler ailesi olan Glutatyon S-Transferazlar (GST'ler), doğrudan detoksifikasyon yoluyla ilaç direncinin gelişmesine neden olurlar. GST'lerin pi (π) ve mu (µ) sınıfları, hücresel sağkalımda ve ayrıca kanser gelişiminde düzenleyici bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada, HT-29 KRK hücre hattında in vitro EMT modeli oluşturulmuş ve EMT, immünohistokimyasal ve biyokimyasal yöntemler kullanılarak gösterilmiştir. HT-29 KRK hücrelerinin epitelyal ve mezenkimal fenotiplerinde GST-π ve GST-µ ekspresyon ve protein düzeyleri belirlenmiştir. Her iki formda oksidatif stres oluşturulmuş ve oksidatif hasar tespit edilmiştir. HT-29 KRK hücrelerinin epitelyal ve mezenkimal fenotiplerinde oksidatif hasar ile GST izoenzimlerinin gen ve protein düzeyleri arasındaki korelasyon belirlenmiştir. HT-29 KRK hücrelerinin her iki fenotipi, FDA onaylı bir GST inhibitörü olan etakrinik asit (ETA) ile muamele edilmiştir. ETA muamelesini takiben GST izoenzimlerinin ekspresyon ve protein düzeyleri belirlenmiştir. Testler GST inhibitörünün KRK'da EMT üzerindeki etkisini araştırmak için HT-29 KRK hücrelerinin oksidatif olarak hasar oluşturulmuş epitelyal ve mezenkimal fenotipleri için tekrarlanmıştır. Epitelyal ve mezenkimal fenotipler, ayrıca yeni terapötik protokolün etkinliğini araştırmak için adjuvan tedavi kombinasyonu ile ve adjuvan tedavi kombinasyonu ve ETA ile tedavi edilmiştir. Boş ve ETA yüklü PLGA-b-PEG nanopartiküller ve mPLGA-PEG-SS-ETA nanokonjugatları nanopresipitasyon tekniği ile hazırlanmıştır. Bu nanoformülasyonlar ortalama partikül büyüklüğü, PDI, zeta potansiyeli açısından ve morfolojik olarak karakterize edilmiştir. Nanoformülasyonların ETA yükleme kapasitesi ve yükleme verimliliği, valide HPLC yöntemi ile belirlenmiştir. Optimize edilmiş nanoformülasyonlar, hedefleme çalışmaları için için HT-29 hücrelerinin mezenkimal fenotipine özgü Vimentin (Vim) monoklonal antikoru ile konjuge edilmiştir. Nanoformülasyonların in vitro sitotoksisitesi L929 hücrelerinde belirlenmiştir. Epitelyal ve mezenkimal fenotipler, hedefe yönelik yeni terapötik protokolün etkinliğini araştırmak için, adjuvan tedavi kombinasyonu ve ETA yüklü ve mezenkimal fenotip hedefli nanoformülasyonlarla tedavi edilmiştir. İmmün sistemi baskılanmış Wistar sıçanlarda in vivo EMT modeli oluşturulmuştur. Yeni hedefe yönelik terapötik protokolün in vivo etkinliğini araştırmak için hayvanlar, adjuvan tedavi kombinasyonu ve adjuvan tedavi kombinasyonu ile ETA yüklü ve mezenkimal fenotip hedefli nanoformülasyonlarla tedavi edilmiştir. HT-29 KRK hücrelerinde in vitro EMT modeli başarıyla oluşturulmuştur. HT-29 hücrelerinin mezenkimal fenotipinde, GST-π'nin yüksek ekspresyonu ve protein seviyeleri gözlenmiş, ancak GST-µ ekspresyon paternlerinde dikkate değer bir fark gözlenmemiştir. ETA, PLGA-b-PEG nanopartiküllere başarıyla yüklenmiştir. ETA ayrıca disülfid bağı yoluyla mPEG-PLGA kopolimerine konjuge edilmiş ve sonuçta oluşan polimer nano boyutlu taşıyıcı sistemlere kendiliğinden dönüşmüştür. ETA yüklü nanoformülasyonlar, dar bir boyut dağılımı ile 115-130 nm aralığında elde edilmiştir. Vim mAb konjugasyonu ile her iki nanoformülasyon da mezenkimal fenotipe başarı ile hedeflenmiştir. Hedefe yönelik formülasyonların hücre içine alımları daha yüksek olup, GST-π izoenzimi üzerinde daha düşük konsantrasyonlar ile inhibisyon etkisi göstermiştir. HT-29 KRK hücrelerinin enjeksiyonu ile immün sistemi baskılanmış Wistar ratlarda başarılı bir şekilde in vivo EMT modeli oluşturulmuştur. EMT oluşumu gözlenen hayvanlarda GST-π izoenzimi ekspresyon seviyelerinde artış gözlenmiştir. ETA yüklü ve mezenkimal fenotipe hedeflendirilmiş nanoformülasyonlar adjuvan tedavi etkinliğini arttırarak oluşan granulom boyutlarında küçülmeyi sağlamıştır.
Özet (Çeviri)
Colorectal cancer is the third leading cause of cancer-related deaths worldwide. For colorectal cancers that have not spread to distant sites, surgery is usually the primary or first treatment option. However, chemotherapy (neoadjuvan, adjuvan and advanced-stage chemotherapy) is still widely used. Several chemotherapeutic agents are available for the treatment of CRC, but eventually cancer relapse occurs. A major impediment in the success of available therapies is the recurrent adaptation of cancer cells, leading to metastases, which are often considered as the point of no return, and are associated with the worst outcome. Therefore, understanding the mechanisms that drive resistance of cancer cells bears special importance. In the recent years, epithelial-mesenchymal transition (EMT), naturally occurring transdifferentiation program, is believed to play an important role in resistance toward chemotherapeutics. Although EMT is widely demonstrated to play a critical role in chemoresistance and metastasis, the potential signaling network between EMT and drug resistance is still unclear. Glutathione S-Transferases (GSTs), a family of isozymes that catalyze the reaction of glutathione (GSH) with electrophiles of both endogenous and xenobiotic origins, assist in the development of drug resistance through direct detoxification. The pi (π) and mu (µ) classes of GSTs play a regulatory role in cellular survival and also in development of cancer. Thus, in the present study, in vitro EMT model was created in HT-29 CRC cell line and EMT was demonstrated using immunohistochemical and biochemical methods. Expression and protein levels of GST-π and GST-µ in the epithelial and mesenchymal phenotype of HT-29 CRC cells was determined. Oxidative stress was generated and oxidative damage was detected; correlation between the oxidative damage and GST isoenzymes was determined at gene and protein levels in the epithelial and mesenchymal phenotypes of HT-29 CRC cells. Both phenotypes of HT-29 CRC cells were treated with ethacrynic acid (ETA) that is a FDA approved GST inhibitor. Expressions of the GST isoenzymes and their protein levels were determined following ETA treatment. Assays were repeated for oxidatively damaged epithelial and mesenchymal phenotypes of HT-29 cells in order to investigate the effect of GST inhibitor on EMT in CRC. Epithelial and mesenchymal phenotypes were treated with adjuvant therapy combination and also with the adjuvant therapy combination plus ETA to investigate the efficacy of the new tharapeutic protocol. Blank and ETA loaded PLGA-b-PEG nanoparticles and mPLGA-PEG-SS-ETA nanoconjugates were prepared by nanoprecipitation technique. These nanoformulations were characterized in terms of mean particle size, PDI, zeta potential and morphology. ETA loading capacity and loading efficiency of nanoformulations were determined by validated HPLC method. The optimized nanoformulations were coupled with Vimentin (Vim) monoclonal antibody specific to mesenchymal phenotype of HT-29 CRC cells for targeted delivery. In vitro cytotoxicity of nanoformulations were determined on L929 cells. Epithelial and mesenchymal phenotypes were treated with adjuvant therapy combination plus ETA loaded and mesenchymal phenotype targeted nanoformulations to investigate the efficacy of the new targeted therapeutic protocol. In vivo EMT model was created in the immunosuppressed Wistar rats. Animals were treated with adjuvant therapy combination and adjuvant therapy combination plus ETA loaded and mesenchymal phenotype targeted nanoformulations to investigate the in vivo efficacy of the new targeted therapeutic protocol. In vitro EMT model was successfully established in HT-29 CRC cells. In mesenchymal phenotype of HT-29 cells, elevated expression and protein levels of GST-π were observed, however, no remarkable difference in GST-µ expression patterns was observed. GST inhibitor ETA was successfully loaded in PLGA-b-PEG nanoparticles. ETA was also conjugated to PLGA-b-PEG copolymer via disulphide bond and resulting polymer self-assembled into nanosized particles. ETA loaded nanoformulations in the range of 115 to 130 nm with a narrow size distribution were obtained. Both nanoformulations were successfully targeted to mesenchymal phenotype with Vim mAb conjugation. Targeted formulations had higher cell uptake rates and showed inhibition effect on GST-π isoenzyme activity even at lower concentrations. In vivo EMT model were successfully induced by the injection of HT-29 CRC cells in immuno-suppressed Wistar rats. Increased levels of GST-π isoenzyme expression in animals with EMT formation were observed. ETA-loaded and mesenchymal phenotype targeted nanoformulations increased adjuvant therapy efficacy and reduced formed granuloma sizes.
Benzer Tezler
- Meme kanserli hastalarda glutatyon s-transferaz izozimlerin çoklu ilaç direnç mekanizmasındaki proteinlerle olan ilişkilerinin incelenmesi
The exami̇nati̇on of of the relationships between glutathione s-transferase isoenzymes and proteins in multidrug resistance mechanism in the breast cancer patients
ARZU KAYA KOÇDOĞAN
- Kurşun nitrat ve kadmiyum klorür'ün rat akciğer dokusu üzerine toksik etkisi ve sesamolün koruyucu rolü
Toxic effect of lead nitrate and cadmium chloride on rat lungtissue and the protective role of sesamole
ELVAN TALAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyolojiGazi ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YUSUF KALENDER
PROF. DR. MELTEM UZUNHİSARCIKLI
- Sıçanlarda gentamisin ile oluşturulan deneysel testis hasarı üzerine kuersetin'in etkileri
Effects of quercetin on testicular damage experimentally created with gentamicin in rats
AYŞE FİRUZE BIYIK
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2021
Histoloji ve EmbriyolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ESİN YULUĞ
- Sıçanlarda gentamisin ile oluşturulan deneysel testis hasarı üzerine kurkuminin etkileri
Effects of curcumin on gentamicin-induced experimental testicular injury in rats
TENZİLE BEYZA DURMUŞ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2024
Histoloji ve EmbriyolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ESİN YULUĞ
- Characterisation of glutathione S-Transferase activity in Turkhish red pine (Pinus brutia ten): Variation in environmentally cold stressed seedlings
Kızılçam bitkisinde glutatyon S-Transferaz enziminin karakterizasyonu: Soğuk stresi altındaki Kızılçam fidanlarında glutatyon S-Transferaz enzim aktivitesindeki varyasyonlar
SEYHAN BOYOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUDE İŞCAN
UZMAN ZEKİ KAYA