miR96 and miR182-driven regulation of cytoskeleton in glioblastomas
Glioblastomalarda hücre iskeletinin miR96 ve miR182 aracılı regülasyonu
- Tez No: 560908
- Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 125
Özet
Glioblastoma multiforme (GBM), en sık görülen beyin tümörü formlarından biridir. GBM, metastas yapmamakla beraber oldukça aşırı derecede invazif bir tümör tipi tipidir. GBM sağlıklı beyin dokularına invazyon gerçekleştirdiği için tam olarak tedavi edilemez. GBM tedavisi sonrasında çok düşük yoğunlukta GBM hücresi hayatta kalsa bile sağlıklı beyin dokularını yeniden istila edebildiği için hastaların ölümüne sebep olurlar. Bu nedenle, GBM hücrelerinin hareketliliğinin ve invazyonunun arkasındaki moleküler mekanizmaların derinlemesine araştırılması etkili GBM tedavilerinin gelişimi için gerekmektedir. Hücresel hareketlilik için, hücrelerin invadapodya benzeri protrüzyon çıkıntıları oluşturması gerekmektedir. Söz konusu hücresel yapıların oluşumu doğrudan hücre iskeleti ile, özellikle de aktinler ve tubulinler ile doğrudan ilişkilidir. İnvadapodya oluşumu öncelikle aktin filamentlerin protrüzyon bölgesinde bir hücresel çıkıntı oluşturmasıyla başlar. Oluşturulan bu protrüzyon çıkıntısının, bölgeye taşınan mikrotübüller tarafından protrüzyon doğrultusunda itilmesi ile de invadapodya uzaması gerçekleştirilir. İnvadapodya oluşumunda ve uzamasında görev alan aktin filamentler ve mikrotubuller, translasyon sonrasında aktin ve mikrotubul ilişkili proteinler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmektedir. Aktin bağlayıcı bir protein olan palladin, invadopodia ve hücresel hareketlilik için gerekli olan kontraksiyon fiberlerinin oluşumları sırasında aktinleri sıkıca paketleyerek görev alır. Bir mikrotubul kesici protein olan spastin, mikrotüpleri küçük parçalara böler ve invadopodia ile ilişkili proteinlerin hücresel taşınımını ve invadopodia uzamasını regüle eder. Spastinin ve palladinin birçok kanser türünde değişen anlatım profiline sahiptir. Ayrıca kanser türleri arasında en öldürücülerinden biri olan ve glial hücrelerden köken alan glioblastomalarda spastin ifade düzeyinin artış gösterdiği ortaya konulmuştur. Glial astrosit hücreleri ile yapılan immunositokimya ve immünoblotlama analizlerinde Spastin seviyesinin glial hücrelerde, glioblastomalara göre, tespit edilemeyecek kadar az seviyede iken; glioblastoma hücre hatlarında spastin ekspresyonunun ciddi düzeyde artış gösterdiği ortaya çıkarılmıştır. Glioblastoma hücrelerinde artan bu spastin ifadesinin hücre motilite ve migrasyon kapasitesini, dolayısı ile metastazı indüklediği ve bu nedenle spastinin glioblastomalarda metastazı önlemede terapötik hedef olarak alınabilecek bir molekül olduğu öne sürülmektedir. Bir aktin bağlayıcı protein olan palladinin de hücre motilitesini doğrudan regüle ettiği rapor edilmiştir. Ayrıca bir çok metastatik kanser türünde palladinin aşırı ifadesi de saptanmıştır. Spastin ve palladinin fonksiyon kaybı nörodejeneratif ve gelişimsel bozukluklara neden olmaktadır. Bu durum, spastinin ve palladinin etkileştiği proteinler ile sitokiyometrik oranda ifadesinin hücre içerisindeki biyolojik süreçlerin doğru bir şekilde yürütülmesindeki gerekliliğini gözler önüne sermektedir. Protein ifadelerindeki bu hassas düzenlenme, post-transkripsiyonel seviyede miRNA'lar aracılığıyla gerçekleştirilmektedir. miRNA'lar; mRNA degredasyonu, deadenilasyonu veya translasyonal inhibisyon aracılığıyla gen ifadesinin susturulmasında rol oynayan yaklaşık 22 nükleotidden oluşan kodlanmayan RNA'lardır. miRNA'lar genomda diğer genlerin yanında, kodlama yapan veya kodlama yapmayan genlerin intronlarının ve ekzonlarının içerisinde bulunabilmektedir. Günümüze kadar 1000'den fazlası insan genomunda bulunmak üzere, ökaryot genomlarında yaklaşık 2200 miRNA'nın var olduğu rapor edilmiştir. Ayrıca, miRNA'ların ökaryotik hücrelerde evrimsel süreçte korunmuş olması göz önüne alındığında gen regülasyon mekanizmalarında temel eleman olabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle, son yıllarda yapılan çalışmalar miRNA'ların birçok biyolojik süreçteki varlığının yanı sıra, kanser gibi pek çok hastalığın patogenezindeki muhtemel etkisinin incelenmesi üzerine yoğunlaşmıştır Aktin filamentlerinin ve mikrotubullerin spastin ve palladin tarafından translasyon sonrasında (post-translasyonal seviye) düzenlenmesinin yanı sıra, embriyojenez ve nörojenezde gibi süreçlerde rol oynayan spastin ve palladin gibi genlerin regülasyonu, transkripsiyon sonrası (post-transkripsiyonel) seviyede mikroRNA'lar tarafından hızla gerçekleştirilir. Bu nedenle, spastin ve palladinin olası düzenleyici miRNA'larının belirlenmesi, GBM hücre hareketliliğinin moleküler yolaklarını aydınlatmak için kritik önem taşımaktadır. Bu çalışmada, SPAST ve PALLD 3'UTR bölgelerindeki putatif miR96 ve miR182 bağlanma bölgeleri biyoinformatik araçlar kullanılarak tahmin edilmiştir. SPAST ve PALLD'nin 3'UTR bölgesi üzerinden miR96 ve miR182 tarafından doğrudan düzenlenmesi, ikili lusiferaz raportör deneyi ile analiz edilmiştir. Bu putatif miRNA'ların SPAST ve PALLD üzerindeki etkileri qRT-PCR ile belirlenmiştir. Ayrıca, U251 MG hücrelerinde SPAST ve PALLD seviyelerindeki azalışın, spastin ve palladin protein seviyelerine etkisi kantitatif Western blot yöntemi ile araştırılmıştır. miR96 ve miR182'nin hücresel metabolizmayı etkileyip etkilemediğini belirlemek için MTT hücre metabolizma tayin deneyi ve miR96 ve miR182'nin hücresel canlılığı etkileyip etkilemediğini belirlemek içinde tripan mavisi hücre canlılığı deneyi gerçekleştirilmiştir. miR96 ve miR182'nin GBM hücre hareketliliği üzerindeki spastin ve palladin aracılı inhibitör etkileri, U251 MG hücrelerinde yara iyileşme modeli deneyi ile analiz edilmiştir. İstatistiksel analizler için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır. miR96 ve miR182, spastin ve palladini, 7mer (GUGCCAA) ve evrimsel olarak korunan 8mer (UGUGCCAA) bölgelerinden doğrudan regüle ettiği saptanmıştır. miR96 ve miR182, SPAST ve PALLD geninin anlatımını hem transkript seviyesinde U-87 MG ve U251 MG hücre hatlarında azalttığı tespit edilmiştir. Ayrıca U251 MG hücre hattında miR96 ve miR182'nin spastin ve palladin protein seviyelerini de azalttığı tespit edilmiştir. Yara iyileşme modeli deneyinde miR96 ve miR182'nin aşırı ifadesi sağlandığında, hücre hareketliliğinin inhibe edilmesine neden olduğu saptanmıştır. miR96 veya miR182 ile transfekte edilmiş U251 MG hücrelerinde, miR96 ve miR182 dirençli konstraklar ile spastin ve palladin seviyelerindeki azalmasının önlenmesi sonucunda hücre motilitesinin inhibisyonun da büyük ölçüde önlendiği saptanmıştır. Bunun sonucunda da miR96 ve miR182'nin spastin ve palladin üzerinden hücre motilitesini inhibe ettiği gözler önüne serilmiştir. İlginç bir şekilde, miR96 ve miR182'nin hücre canlılığını veya hücre metabolizmasını etkilemediği MTT ve hücre canlılık deneyleri ile tespit edilmiştir. Böylelikle, yara iyileşme modeli deneyinin sonuçlarının doğrudan motilite ile ilişkili olduğu ortaya konmaktadır. Sonuçlarım, miR96 ve miR182 aşırı ekspresyonlarının, mikrotubul ilişkili protein olan spastini ve aktin ile ilişkili protein olan palladini regüle ederek hücre iskeletini düzenlediği ve GBM hücrelerinin hareketliliğini inhibe ettiğini göstermektedir. Bu bulgular, miR96 ve miR182 ile hedeflerinin spastin ve palladinin, GBM terapisindeki potansiyel kullanımları için daha ayrıntılı olarak araştırılması gerektiğini göstermektedir. miR96 ve miR182'nin hücre motilitesini inhibe ettiği yolakların detaylı aydınlatırması, miR96 ve miR182 genlerinin GBM tedavisinde bir terapötik olarak kullanılma potansiyelini açığa çıkaracaktır.
Özet (Çeviri)
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common forms of brain tumors. As an excessively invasive tumor type, GBM cannot be fully cured due to its invasion ability into healthy brain tissues. Even a few survived GBM cells can re-invade to the whole brain and this invasion results in patients' death. Therefore, molecular mechanisms behind the GBM migration and invasion need to be deeply investigated for the development of effective GBM treatments. Cellular motility and invasion are strictly associated with the cytoskeleton, especially with actins and tubulins. Actin filaments and microtubules are tightly regulated by actin- and microtubule-binding proteins at the post-translational level. Palladin, an actin-binding protein, tightly bundles actins during initial invadopodia and contraction fiber formations which are essential for cellular motility. Spastin, a microtubule-severing protein, cuts microtubules into small pieces and acts on invadopodia elongation and cellular trafficking of invadopodia-associated proteins. In addition to the regulation of actin filaments and microtubules at the post-translational level by spastin and palladin, regulation of genes involved in embryogenesis and neurogenesis such as spastin and palladin, are rapidly carried out by microRNAs at the post-transcriptional level. Therefore, determining possible regulatory miRNAs of spastin and palladin is critical to elucidate GBM motility. In this study, putative miR96- and miR182-binding regions in SPAST and PALLD 3'UTR regions were predicted using bioinformatic tools. Direct regulation of SPAST and PALLD through 3'UTR by miR96 and miR182 was analyzed by a dual luciferase reporter assay and the effects of these putative miRNAs on SPAST and PALLD were determined by qRT-PCR. Moreover, the effects of SPAST and PALLD down-regulations on spastin and palladin protein levels in U251 MG cells were investigated by quantitative Western blotting. MTT cell metabolism assay was used to determine if miR96 and miR182 affect cellular metabolism and trypan blue cell viability assay was used to determine if miR96 and miR182 affect cellular viability. Spastin- and palladin-mediated inhibitory effects of miR96 and miR182 on GBM motility were analyzed with scratch wound healing assay in U251 MG cells. One-way ANOVA was used for statistical analysis. miR96 and miR182 regulate spastin and palladin through 7mer (GUGCCAA) and evolutionarily conserved 8mer (UGUGCCAA) regions in their mRNAs. miR96 and miR182 down-regulate SPAST and PALLD at both transcript and protein levels. Overexpression of miR96 and miR182 resulted in inhibition of the motility. However, overexpression of spastin and palladin induced the motility. Spastin and palladin rescue of miR96- or miR182-transfected U251 MG cells resulted in diminished effects of the miRNAs and rescued the motility. Interestingly it was shown that miR96 and miR182 do not affect cell viability or cellular metabolism. Results demonstrate that miR96 and miR182 overexpression inhibit GBM motility by regulating cytoskeleton through the microtubule-associated protein spastin and actin-associated protein palladin. These findings suggest that miR96 and miR182 and their targets spastin and palladin should be investigated in more detail for their potential use in GBM therapy.
Benzer Tezler
- Üretra darlığı modelinde PRP'nin tedavi edici etkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of the therapeutic effect of PRP in the urethral stricture model
GÖKHAN TEMELTAŞ
Doktora
Türkçe
2021
Histoloji ve EmbriyolojiManisa Celal Bayar ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MAHMUT KEMAL ÖZBİLGİN
- Kuraklık stresi ve humik asitin ekmeklik buğdayda (Triticum aestivum L.) bazı genlerin mRNA ifade seviyeleri ve DNA konformasyon değişimlerine etkisi
The effect of drought stress and humic acid on mRNA expression levels of some genes and DNA conformation changes in bread wheat (Triticum aestivum L.)
ESRA ARSLAN
- HepG2 hücre hattında Pirolokinolin kinon (PQQ) ve Koenzim Q10'in mitokondriyal genler, mitomir'ler ve hücresel özellikler üzerine etkilerinin incelenmesi
Effects of Pyrroloquinoline quinone (PQQ) and coenzyme Q10 on mitochondrial genes, mitomirs and cellular properties in HepG2 cell line
MUHAMMED ALİ NALBANT
Doktora
Türkçe
2023
GenetikBilecik Şeyh Edebali ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ONUR EROĞLU
- Gestasyonel diyabetes mellitus'lu hastalarda mir7-5p, miR16-5p, mir142-3p, miR144-3p, mir222-3p ve mir409-3p'nin ekspresyon düzeylerinin araştırılması
Investigation of the expression levels of mir7-5p, mir16-5p, miR142-3p, mir144-3p, mir222-3p and miR409-3p in patients with gestational diabetes mellitus
TEFİDE SİMGE ATALIK
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiTrakya ÜniversitesiBiyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAKAN GÜRKAN
- Mir-96 ifadesinin otofaji üzerinde etkisinin meme kanseri hücre hatlarında araştırılması
Investigation of the effect of mir-96 expression on autophagy in breast cancer cell lines
SEVİL KIRKBEŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
Tıbbi BiyolojiGaziantep ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUSTAFA ULAŞLI