Geri Dön

Analysis of functional domains of alternative splicing isoforms

NFIB alternatif kırpılma izoformlarının işlevsel bölgelerinin analizi

PDF İndir

  1. Tez No: 579774
  2. Yazar: ŞEYMA VARINCA
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 97

Özet

Transkripsiyon faktörleri, hedef genlerinin ekspresyonlarını dolaylı veya direkt olarak aktive etmek veya baskılamak suretiyle düzenleyen proteinlerdir. Bu proteinler tarafından gerçekleştirilen gen regülasyonu, özellikle gelişim sürecinde ve kök hücre farklılaşmasında hayati önem arz etmektedir. Nükleer Faktör I (NFI) transkripsiyon faktörü ailesi, gelişim sürecinde, nöral kök hücre farklılaşmasında, akciğer gelişiminde, megakaryosit özelleşmesinde ve daha birçok önemli hücresel süreçte rol oynarlar. Bu geniş regülasyon alanları, bu transkripsiyon faktörlerinin gelişimin daha erken evrelerinden itibaren ekspresyon kontrolünde rol oynamaya başladıklarını işaret etmektedir. NFI ailesi dört gen (NFIA, NFIB, NFIC, and NFIX) kodlanan dört proteinden (NFIA, NFIB, NFIC, and NFIX) oluşmaktadır. Bu proteinler özellikle N-ucu bölgelerinde neredeyse tamamen korunmuş olan dimerizasyon ve DNA'ya bağlanma bölgeleri bulundurmaktadır. Homodimer veya heterodimer oluşturmak suretiyle bağlandıkları konsensus sekans olan "TTGGC(N5)GCCAA' dizisine afiniteleri eşittir. C-ucu bölgelerinde ise daha az korunmuş olan ve farklı ekzon kombinasyonları tarafından kodlanan transaktivasyon/baskılama bölgeleri bulunur. Proteine fonksiyonel özelliklerini kazandıran bölge bu C-ucu bölgesidir. Proteine fonksiyonel karakteristiğini kazandıran bölge bu C-ucu bölgesidir. C ucu bölgelerinin en ucunda birçok prolin amino asidinin oluşturduğu bir kısım korunmaktadır ve bu prolince zengin bölgenin histon proteinleriyle etkileşmek suretiyle nükleozom yapısında modifikasyonlara sebep olarak transkripsiyonu regüle ettiği düşünülmektedir. NFI proteinleri hem gelişim sürecinde kök hücre farklılaşmasında hem de yetişkin kök hücrelerinde transkripsiyonel regülasyonda önemli rollere sahiptirler. Merkezi sinir sistemi gelişimi sürecindeki kök hücrelerdeki etkileri, yetişkin beyin kök hücrelerindeki etkilerinden farklıdır. Gelişim evresinde genellikle kök hücre yenilenmesiyle ilişkili genlerin ifadesini bastırırken; hücre özelleşmesi, hücre göçü, akson ve dendrit oluşumu gibi hücre farklılaşması ile ilintili genlerin ifadelerini arttırdıkları saptanmıştır. Yetişkin kök hücrelerinde ise, kök hücre devamlılığı ile ilişkili genlerin ifadesini arttırırken, hücre farklılaşması ile ilişkili genlerin ifadesini baskıladıkları bilinmektedir. Bunlara ek olarak, NFIB kanser ile de ilişkilendirilmektedir. NFIB ifadesi arttırıldığında tümör büyümesinin durdurulduğu gözlemlenmiştir. Ancak, genellikle kaydedilen tümör baskılayıcı rolüne rağmen NFIB'nin onkogenik etkisinin görüldüğü de olmuştur. NFIB proteininin insanda dört kanonik izoform mevcuttur* ve bunların ikisi (NFIB1, NFIB2) uzun izoformlar olup 11. ekzon hariç 1-12 ekzonların tümünü bulundururken; bir diğer izoform (NFIB3) daha kısadır ve 9., 10. ve 11. ekzonları barındırmamaktadır. En kısa izoform olan NFIB-S (NFIB4) ise, alternatif bir başlangıç kodonunun kullanılması sonucunda 11. ekzon da dahil olmak üzere 5-12 ekzonları bulundurmaktadır ve 11. ekzonun bulunması sonucu oluşan çerçeve kayması bu izoforma farklı bir N-ucu aminoasit dizisi kazandırmaktadır. Sonuçta oluşan bu NFIB-S izoformunun farklı olan 12. ekzonu, fare Nfib izoformlarının 12. ekzonlarına benzemekle birlikte, asıl ilgi çekici olan ise NFIB-S izoformunun bu NFI transkripsiyon faktörlerinin tümünde ortak olarak korunmuş olan dimerizasyon ve DNA-bağlanma bölgelerini taşıyan N-ucu bölgesini bulundurmamasıdır. İnsan NFIB izoformlarının taşıdıkları farklı transkripsiyon düzenleme bölgelerinin yol açabileceği farklı fonksiyonların araştırılması, bu proteinlerin gelişim ve nöral hücre farklılaşmasındaki rollerinin anlaşılması ve kanserdeki olası etkilerinin aydınlatılması için önem arz etmektedir. Tüm bunlardan hareketle, bu çalışmada öncelikle ilgili izoformları ifade eden memeli ekspresyon vektörleri hazırlanmış, daha sonra bu proteinlerin HEK293T hücrelerinde ifadesi artırımı suretiyle in vitro DNA-bağlanma ve promotor-aktivasyonu/baskılaması deneyleri gerçekleştirilmiştir. Lusiferaz raportör deneylerinde, izoformların aktivasyon kapasitelerinin saptanması için GFAP promotoru kullanılırken; izoformların baskılama kapasitelerinin belirlenmesi için p21 promotoru kullanılmıştır. Farede bulunan iki Nfib izoformu, Nfib3 ve Nfib4, insandaki NFIB3 ve NFIB4 izoformları ile %99 örtüşmektedir ve bu fare izoformlarının var ise fonksiyonel farklılıklarının, insan NFIB izoformlarının fonksiyonlarını da yansıtacağı düşünülmektedir. Biz bu çalışmada iki fare izoformunun fonksiyonel karşılaştırmak için promotor raportör deneylerinde aktivasyon ve baskılama kapasitelerini belirledik. Ancak, bu deneylerde Nfib4 izoformu, tutarlı olarak Nfib3 izoformundan daha yüksek düzeylerde ifade edilmiş ve her iki izoformun ekspresyon seviyeleri eşitlenememiştir. Bu nedenle, iki izoformun aktivasyon/baskılama kapasitelerinin farklı olup olmaması konusunda kesin bir sonuca ulaşılamamıştır. Diğer yandan, NFIB-S izoformunun olası aktivasyon/baskılama kapasitesinin belirlenmesi amacıyla yapılan promotor raportör deneylerinde doğru kontrol grubunun belirlenmesinin önemi daha da öne çıkmıştır. NFIB-S hem GFAP hem de p21 promotor aktivasyonunda ekzojen protein ifade etmeyen kontrol grubuna göre düşüşe neden olmaktadır. Ancak, aktivasyon seviyelerindeki bu düşüşün, transfeksiyona tabi tutulan hücrelerdeki ekzojen protein üretiminin oluşturduğu stresten kaynaklanıyor olabileceğini düşünerek ekledğimiz GFP ifade eden kontrol grubu ile kıyaslandığında, NFIB-S'in promotor aktivitesinde istatistiksel açıdan önemli sayılabilecek bir değişikliğe yol açmadığı düşünülmektedir. Her ne kadar NFIB-S izoformu DNA-bağlanma ve dimerizasyon bölgesini bulundurmasa da, yine de bu izoformun başka bir protein bölgesi aracılığı ile DNA üzerindeki bilinen NFI bağlanma bölgelerine bağlanıp bağlanamayacağı, bu izoformun transkripsiyonel regülasyonda rolü var ise hangi şekilde olabileceğinin aydınlatılması yolunda önemli bir ilk adımdır. Bu amaçla yapılan in vitro DNA bağlanma deneyleri, ne NFIB-S'nin ne de NFIB-TAD'ın NFI bağlama motifleri ile etkileşmediği görülmektedir (NFIB-TAD, NFIB'nin N-ucu DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi çıkartılmak suretiyle oluşturulmuş yapay bir kısaltılmış proteindir). NFIB-S'nin tam boy NFIB ile olası bir etkileşimi sonucunda, NFIB'nin DNA'daki ilgili kısımlara bağlanmasını etkileyebileceği görüşüyle uygulanan ve her iki izoformun birlikte in vitro inkübasyonunu müteakip NFIB'nin DNA'ya bağlanmasını inceleyen deneylerde, NFIB-S'nin DNA-bağlanma seviyesine herhangi bir etkisi saptanamamıştır. Bu etki çok düşük miktarda olduğundan veya bu etkileşimlerdeki protein afinitelerinin düşük olmasından dolayı da saptanamamış olabilir. Bu ihtimalin test edilmesi için, birlikte inkübasyon deneylerinde tam boy NFIB miktarına kıyasla daha yüksek oranlarda NFIB-S kullanılabilir. Bir başka yaklaşım ise bu iki proteinin ilgili bir hücre hattında birlikte ifadesi sonucu kromatin immunopresipitasyonu ile elde edilebilecek in vivo etkileşimleri ile ilgili bilgilerdir. Bunlara ek olarak, bu proteinlerin işlevlerinin inceleneceği hücre hatlarının seçimi, çevresel faktörlerin transkripsiyonel regülasyonda modüler etkisinin yadsınamayacağı gerçeği dolayısıyla çok mühimdir. *: Biz bu çalışmaya başladığımızda GeneBank verilerine göre 4 kabul edilmiş izoform mevcuttu ancak Mayıs 2019'da yapılan bir güncelleme ile bu sayı 28'e yükseldi. Ancak hala NFIB1 en uzun izoform olma özelliğini korumaktadır. Buna ek olarak, NFIB-S, N-ucu DNA bağlanma bölgesini bulundurmayan tek ilgi çekici izoform olmaya devam etmektedir.

Özet (Çeviri)

Transcription factors which regulate gene expression in the developing embryo control cellular processes such as proliferation, differentiation and migration. Disruption of the same set of transcription factors is also associated with various types of cancer in adults. Nuclear Factor I (NFI) family of transcription factors, for example, are expressed by stem cells during development and in the adult stem cell niche and drive many developmental processes such as neural stem cell differentiation, lung maturation, and hematopoiesis. In vertebrates there are four NFI genes: NFIA, NFIB, NFIC and NFIX; however, each gene produces numerous alternative splicing isoforms that may have different interaction partners and functional characteristics. NFIs carry a highly conserved N-terminal DNA-binding and dimerization domain through which they form homo- or heterodimers and bind to DNA on specific consensus sequences. NFI C-terminal transcription modulation domain is less conserved, and allow NFIs to activate or repress target gene expression. The diverse C-terminal domain may indeed lead to differences in function as demonstrated by NFIX isoforms that vary in the efficiency of target gene activation. Here we set out to investigate functional differences between NFIB isoforms and focused on two mouse Nfib alternative splicing isoforms, Nfib3 and Nfib4. While Nfib4 bears exons 1-10 and 12; Nfib3 is encoded by exons 1-8 and 12 and 79 residues shorter than Nfib4. We also included an unusual human NFIB isoform, NFIB-S. NFIB-S is a truncated protein encoded by exons 5-12; thus lacks the N-terminal DNA-binding and dimerization domain while carrying a long transcription modulation domain. In order to study these proteins, we first generated the mammalian expression constructs that encode these three isoforms. We selected two NFI target genes, GFAP, which is induced by NFIs and p21 which is repressed by NFI proteins and measure promoter driven luciferase activity. While Nfib3 induced GFAP promoter by 1.7-1.8 fold, Nfib4 activated by 2.5-3 fold in three independent experiments. However, Nfib4 was consistently expressed at higher levels compared to Nfib3, which may account for the difference in GFAP activation. Nfib4 also repressed the p21 promoter more efficiently, 45-67% compared to 37-44% by Nfib3. These differences may be due to differential activation efficacy or expression levels; further experiments are required to determine the underlying mechanisms. We also tested NFIB-S in parallel experiments. Interestingly, NFIB-S reduced GFAP promoter activity compared to pCH mock. When we included GFP in order to control for effects of exogenous protein overexpression, NFIB-S still displayed a modest repressive effect. Neither NFIB-S nor a truncated version of Nfib3 that lacks the N-terminal domain (NFIB-TAD) repressed the p21 promoter significantly. Next, we tested binding ability of NFIB-S to GFAP and p21 NFI-sites by electrophoretic mobility shift assays. Once again, neither NFIB-S and NFIB-TAD interacted with the NFI-sites, while full-length NFIB bound to the NFI-motifs. NFIB-S may act by affecting interactions of full-length NFI proteins with NFI binding partners or NFI sites on genomic DNA. In vitro co-incubation of NFIB-S with full-length NFIB prior to DNA binding did not interfere with NFIB binding to NFI-sites on DNA. While the in vitro binding and reporter assays may not have been able to detect low affinity interactions or replicate in vivo conditions, preliminary data show that NFIB-S does not bind or regulate the selected target genes, GFAP or p21. Thus, further experiements are required to elucidate mechanisms by which NFIB-S acts to regulate cellular differentiation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    713551

    Determination and verification of new targets in liver cancer

    Karaciğer kanserinde yeni hedeflerin belirlenmesi ve doğrulanması

    UMUT EKİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyokimyaDokuz Eylül Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ YAVUZ OKTAY

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    472858

    Investigation of NFIB binding to CDO and FGF19 gene regulatory regions by chromatin immunoprecipitation

    NFIB'nin CDO ve FGF19 gen düzenleyici bölgelerine bağlanmasının kromatin immün çöktürme yöntemiyle araştırılması

    CEMRE LEKTEMUR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR

  3. Tez No

    664507

    Optimization of a translating ribosomal affinity purification method

    Translasyonal rıbozomların afinite saflaştırılmasının optimizasyonu

    IRMAK GÜRCÜOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE ELİF ERSON BENSAN

  4. Tez No

    427838

    The characterization and potential functional role of wdr81, a novel zebrafish gene, associated with cerebellar ataxia, mental retardation and dysequilibrium syndrome (CAMRQ) in humans

    İnsanlardaki serebellar ataksi, zeka geriliği ve dengesizlik sendromu ile ilişkilendirilen ve zebrabalığında yeni bir gen olan WDR81'in karakterizasyonu ve muhtemel işlevsel rolü

    FÜSUN DOLDUR BALLI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HASAN TAYFUN ÖZÇELİK

    DOÇ. DR. MICHELLE MARIE ADAMS

  5. Tez No

    821778

    Joint analysis of SQTL and HI-C reveals spatial proximity between SQTL and target genes across multiple tissues

    SQTL ve HI-C'nin ortak analizi, birden fazla dokuda Sqtller ile hedef genler arasında mekansal yakınlık ortaya çıkarıyor

    BATUHAN ERALP

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolÖzyeğin Üniversitesi

    Yapay Zeka Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EMRE SEFER

Geri Dön