Sıçan elongasyon faktörü 2 (EF-2) geninin klonlanması ve E. coli'de ekspresyonu
Cloning of rat elongation factor 2 (EF-2) gene and its expression in E. coli
- Tez No: 59629
- Danışmanlar: PROF. DR. ENGİN BERMEK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyofizik, Biophysics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1997
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyofizik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 73
Özet
ÖZET Lambda-Zapll bakteriyofajına paketlenmiş total sıçan karaciğer cDNA kü tüphanesi Eco//XI_1-Blue soyunda çoğaltıldı. Bakteri plaklarından alınarak saf laştırman faj DNA'sı, sıçan EF-2 cDNA'sınm PCR ile çoğaltılmasında kalıp olarak kullanıldı. Çoğaltılan 1024 bç uzunluğundaki EF-2 N-terminal fragment» pMal-c2 ve pTrc97A vektörlerine klonlanırken 1353 bç uzunluğundaki diğer N-terminal fragment! sadece pMal-c2 vektörüne klonlandı. EF-2 C-terminal bölgesi ise 1474 ve 1578 bç uzunluklarında iki fragment halinde çoğaltılarak her iki vektöre de klon landı. EF-2'nin bütününü kapsayan cDNA molekülünü çoğaltmak mümkün olmadı. Bu nedenle, çakışan diziler içeren ve bu çakışan bölgede EF-2 cDNA'sını tek bir yerden kesen Bel I enzimi için kesim dizisi taşıyan EF-2 N-terminal (1353 bç), ve EF^2 C-terminal (1578 bç) fragmentleri birleştirilerek bütün EF-2 cDNA molekülü, 2581 bç, elde edildi. Bütün molekül her iki vektöre de klonlandı. Hazırlanan kons- traktlarla farklı E.coli soylarında ekspresyon çalışmaları yapıldı. pMal-c2 vektörü ne klonlanmış 1024 bç uzunluğundaki EF-2 N-terminal fragmentinin E.çoli JM107 soyunda ekspresyonu optimize edilerek 80 kD büyüklüğündeki füzyon proteini el de edildi. pTrc97A vektörüne yerleştirilmiş 1474 bç uzunluğundaki EF-2 C-terminal fragmentinin ekspresyonu ise en yüksek verimle E.coli M15 soyunda sağlandı. C- terminal fragmentinin şifrelediği proteinin beklenen büyüklüğü 55 kD olmasına rağ men 33 kD büyüklüğüne indirgenmiş olarak bulundu. Farklı ekspresyon koşullan, özütleme yöntemleri ile yapılan bütün çalışmalarda protein hep bu büyüklükte elde edildi. 33 kD büyüklüğündeki C-terminal proteini İle bağışıklanmış farelerde mono- klonal antikor eldesi için füzyon çalışmalarına başlandı. Eksprese edilen 33 kD bü yüklüğündeki C-terminal protein kromatografi yoluyla kısmen saflaştmldı. 62
Özet (Çeviri)
SUMMARY Total rat-liver cDNA, which has been packaged into Lambda-Zapll bacteriophage was amplified in XL1-Blue strain of E.coli. Phage particules were collected from the plaques. Phage DNA was purified and used as the template in the PCR amplification reactions of rat EF-2 cDNA. While an N-terminal EF-2 cDNA fragment that was amplified as 1024 bp DNA molecule was cloned into both pMal- c2 and pTrc97A vector plasmids, a 1353 bp long another N-terminal cDNA fragment was cloned only into pMal-c2. The whole of the rat EF-2 cDNA, 2581 bp, could not be amplified by PCR. Therefore, two overlapping rat EF-2 cDNA fragments ( an N- terminal fragment, 1353 bp; a C-terminal fragment, 1578 bp) were prepared and were then joined using the Bel I restriction site that is unique to the overlapping region. The whole of the rat EF-2 cDNA molecule thus prepared, was then cloned into pTrc97A and pMal-c2. With the constructs, a series of expression experiments were carried out using appropriate E.coli host strains. The expression of the 1024 bp rat EF-2 N-terminal cDNA fragment in pMal-c2 was optimised in Ecoli JM107 strain, and an 80 kD fusion protein was obtained. The overexpression of 1474 bp C-terminal cDNA fragment in pTrc97A was achieved in E.coli M15 strain. Although a 55 kD C-terminal protein fragment was expected, the mass of the protein was found to be reduced to 33 kD. Different expression conditions and extraction methods were tried, however, the size of the C-terminal protein fragment did not change. With this stable 33 kD protein fragment mice were immunised and studies of monoclonal antibody preparations were started. This 33 kD C-terminal protein fragment was also partially purified by some chromatografic methods. 63
Benzer Tezler
- Ökaryot elongasyon faktörü 2(EF-2)'nin farklı dokularda eldesi ve miktarlarının karşılaştırılması
Başlık çevirisi yok
ABDULLAH SEVİNÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
1993
Tıbbi BiyolojiMarmara ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEKİ KAN
- Elongasyon faktör-2 (EF-2)'nin hücre içi dönüşüm (turnover) mekanizmaları üzerine bir çalışma: 1G2 hibridoma hücrelerinde yapılan gözlemler
A Study on intracellular turnover of EF-2: Investigation on 1G2 hybridoma cells
HANDAN TÜMER AKÇAKAYA