Kronik miyeloid lösemide CRISPR/CAS9 aracılı yeni nesil gen tedavisi
A new generation gene treatment of chronic myeloid leukemia through the mediation of CRISPR/cas9
- Tez No: 634247
- Danışmanlar: PROF. DR. MAHMUT SELMAN YILDIRIM
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Hematoloji, Genetics, Hematology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Necmettin Erbakan Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 259
Özet
Kanser, moleküler etyopatogeneze sahip, genomda meydana gelen mutasyonlar ile karakterize hücresel seviyede genetik bir hastalıktır. Kronik miyeloid lösemi (KML), genetik temeli gösterilen ilk neoplazmdır. Etyopatoloji, hematopoetik progenitör kök hücrede meydana gelen tek bir mutasyon ile karakterizedir. Bu moleküler patogenezin mekanizması, 9 ve 22. kromozomlar arasında resiprokal translokasyon sonucu oluşan, BCR/ABL1 kimerik onkogenine dayanmaktadır. Yeni oluşan bu füzyon gen, aşırı ve düzensiz tirozin kinaz aktivitesi ile BCR/ABL1p210 onkoproteinini kodlar ve sonuçta KML fenotipine neden olur. Araştırmamızda, KML etyopatogenezinin sorumlusu olan, BCR/ABL1 onkogenine yönelik yeni nesil gen tedavisi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, son keşfedilen genom düzenleme araçlarından CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR associated Cas9) teknolojisi ile KML hücrelerine genetik manipülasyon yapılarak, BCR/ABL1 onkogenini susturmak, kimerik protein üretimini baskılamak hedeflenmiştir. Yapılan bu araştırma; çok basamaklı çalışma yöntemleri ve analiz aşamalarından oluşmaktadır. Bu doğrultuda, CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracının hedefi; KML orjinli K562 hücre hattıdır. K562 hücre hattının uzun süreli kültür optimizasyonu sağlanmış, sitogenetik, moleküler sitogenetik karakterizasyonu yapılmıştır. Genetik manipülasyonun hedefi BCR/ABL1 kimerik onkogenin füzyon kırık noktaları tesbit edilmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi için gRNA sekanslarının plazmid genoma klonlanması ve bakteriyel transformasyon aşamaları gerçekleştirilmiştir. K562 hücre hattında genom düzenleme, lipofektamin ve elektroporasyon aracılı vektörel sistemlerinin transfeksiyonu ile yapılmıştır. Bu çalışma basanmaklarının ardından, BCR/ABL1 füzyon geni üzerinde CRISPR/Cas9 etkinliği; invert mikroskop aracılı GFP sinyal paterni, flow sitometrik hücre saflaştırması, RT-qPCR ekspresyon kantitasyonu ve sanger dizi tekniği ile analiz edilmiştir. BCR/ABL1 füzyon geninin translokasyona giren intronik dizileri tesbit edildi. Bu sekansları hedefleyen CRISPR/Cas9 ürünleri plazmid genomlarına aktarılabildi ve bakteriyel kültürü yapılabildi. Uzun süreli kültür koşullarının CRISPR/Cas9 manipülasyonu öncesi K562 hücrelerinde, BCR/ABL1 ekspresyon seviyesini önemli miktarda arttırdığı tesbit edildi. Manipülasyon sonrası ise ekspresyon miktarının, önemli ölçüde düştüğü belirlendi. Ancak, sanger dizi analizinde, BCR/ABL1 kırık füzyon bölgesinde Crısp/Cas9 aracılı bir mutasyon tesbit edilmedi. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile KML fenotipine neden olan BCR/ABL1 füzyon geni onkoprotein seviyesinin önemli miktarda azaldığı belirlendi. Ayrıca, bu yeni nesil gen tadavi stratejisinin intronik sekanslarda da etkili olabildiği, fiziksel ve kimyasal vektörler aracılığı ile BCR/ABL1 kimerik gen ifadesini düşürebildiği tesbit edildi.
Özet (Çeviri)
Cancer, which has a molecular etiopathogenesis, is a genetic disease at the cellular level characterised by mutations occuring in the genome. Chronic myeloid leukemia (CML) is the first neoplasm whose genetic basis has been shownetiopathology, is based on a single mutation occuring in the hematopoietic progenitor stem cell. The mechanism of this molecular pathogenesis is based on BCR/ABL1p210 chimeric oncogene resulting from reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22. This newly formed fusion gene encodes the BCR/ABL1p210 oncoprotein with excessive and irregular tyrosine kinase activity and eventually causes the CML phenotype. In our study, a new generation gene treatment for BCR/ABL1p210 oncogene, which is responsible for KML etiopathogenesis, is aimed. Accordingly it is aimed to silence BCR/ABL1 oncogene and to suppress chimeric protein production by carrying out genetic manipulation to CML cells by means of CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR associated Cas9) technology,which is one of the recently discovered genome editing tools. This research; consists of multi-step study methods and analysis stages. Accordingly, the goal of the CRISPR/Cas9 genome editing tool is the K562 cell line with CML origin. Long term culture optimization of K562 cell line has been provided and its molecular cytogenetic characterization has been performed. Fusion breakpoints of BCR/ABL1 chimeric oncogene, which is the target of genetic manipulation, were detected. Plasmid genome cloning of gRNA sequences and bacterial transformation steps were performed for CRISPR/Cas9 system. Genome editing in K562 cell line was done by transfection of lipofectamine and electroporation mediated vector systems. After these study steps, the efficacy of CRISPR/Cas9 on BCR/Ab11 fusion gene was analyzed by the invert microscope-mediated GFP signal pattern, flow cytometric cell purification, RT-qPCR expression quantitation and the sanger sequence technique. Intronic sequences, those were in translocation of BCR/ABL1 fusion gene were detected. The CRISPR/Cas9 products targeting these sequences could be transferred to its plasmid genomes and its bacterial culture could be made. Long- term culture conditions were found to significantly increase the level of BCR/ABL1 expression in K562 cells prior to CRISPR/Cas9 manipulation. It was determined that the amount of expression decreased significantly after manipulation. However, no Crısp/Cas9- mediated mutation was detected in BCR/ABL1 fracture fusion region in sanger sequence analysis. It was determined that the oncoprotein level of BCR/ABL1 fusion gene, which caused CML phenotype, was significantly decreased by CRISPR/Cas9 genome editing technology. It was also determined that this new generation gene treatmentstrategy can also be effective in intronic sequences and can reduce BCR/ABL1 chimeric gene expression through physical and chemical vectors.
Benzer Tezler
- Kronik miyeloid lösemide mutasyonların araştırılması ve klinikle olan ilişkilerinin incelenmesi
Investigation of mutations in chronic myeloid leukemia and assessment of the relation between mutations and the clinical response
PELİN AYTAN
Tıpta Yan Dal Uzmanlık
Türkçe
2013
HematolojiÇukurova Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BİROL GÜVENÇ
- Kronik miyeloid lösemide dishevelled proteinlerinin onkojenik etkisinin araştırılması
Investigating oncogenic effects of dishevelled proteins in chronic myeloid leukemia
CEYDA ÇALIŞKAN
Doktora
Türkçe
2016
Tıbbi BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAKKI OGÜN SERCAN
- Kronik miyeloid lösemide tirozin kinaz inhibitörlerine karşı oluşan primer dirençte WNT/β-katenin yolağı antagonistlerinin rollerinin incelenmesi
Investigation of the role of WNT/β-catenin pathway antagonists generated against primary the resistance to tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia
MELEK PEHLİVAN
Doktora
Türkçe
2014
GenetikDokuz Eylül ÜniversitesiTemel Tıp Bilimleri Bölümü
PROF. DR. HAKKI OGÜN SERCAN
- Kronik miyeloid lösemide interferon-alfa tedavisine yanıt oluşumunda etkili mekanizmaların moleküler biyolojik yöntemler ile araştırılması
Mechanism influencing clinical responsiveness to interferon-alpha therapy in chronic myeloid leukemia patients
ZEYNEP SERCAN (YÜCE)
Doktora
Türkçe
2000
Tıbbi BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MERAL SAKIZLI
- Kronik miyeloid lösemi hastalarında farklı T(9;22) kırıklarının tespiti ve tedavi yanıtı ile ilişkisinin araştırılması
Determination of different T(9;22) transcripts and investigation of their relationship with treatment response in chronic myeloid leukemia patients
MERVE ORDU