Evaluation of interactions between SKOV3 cells and HER2 targeted monoclonal antibody with quartz crystal microbalance with dissipation as a novel approach
Disipasyonlu kuvars kristal mikroterazi ile SKOV3 hücreleri ve HER2 hedefli monoklonal antikor arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesi
- Tez No: 637249
- Danışmanlar: PROF. DR. FATMA NEŞE KÖK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Biology, Bioengineering, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 85
Özet
Son yıllarda biyoteknoloji alanında meydana gelen hızlı gelişmeler, biyoteknolojik ilaçların farmasötik endüstrisindeki oranını ve değerini önemli derecede arttırmıştır. Biyoteknolojik moleküller sağlamış oldukları avantajlarla yeni biyoteknolojik ilaçların geliştirilmesi konusunda önemli bir ivme yaratmakta ve biyoteknolojik yöntemlerle üretilen aktif olarak kullanılan ve ruhsatlanan ilaçların sayısı giderek artmaktadır. Biyoteknolojik ilaçlar kanser, kalp hastalıkları ve diyabet gibi toplumda yüksek oranlarda görülen hastalıklar başta olmak üzere birçok değişik sağlık sorununu içeren yaklaşık olarak 200 hastalığın tedavisi için geliştirilen yeni ilaçların büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu ilaçların daha yaygın kullanılan kimyasal ilaçlarla aralarında kritik farklılıklar vardır. Kimyasal ilaçlar, formülleri bilinen, stabil bir yapıya sahip ve kimyasal sentez ile üretilen küçük moleküller iken, biyofarmasötik ürünler heterojen bir yapıya sahip olan karmaşık ve büyük biyomoleküllerdir. Üretim esnasındaki proses değişikliklerine duyarlı olmayan veya çok az duyarlı olan kimyasal ilaçların aksine, biyofarmasötikler proses değişikliklerine karşı son derece duyarlıdır. Biyofarmasötiklerin büyük çoğunluğu rekombinant DNA teknolojisi ile canlı sistemler, özellikle bakteri ve memeli hücreleri, kullanılarak üretilir. Monoklonal antikorlar (mAb), biyofarmasötiklerin en büyük sınıfıdır ve şu anda kanser, enflamatuar hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar, organ nakli, enfeksiyonlar, solunum hastalıkları ve oftalmolojik hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Tümör hücreleri yüksek hızda çoğalmalarına ya da anormal yapıda olmalarına rağmen hastanın kendi hücreleri olduğu için genellikle bağışıklık sistemi tarafından tanınıp hedeflenemez. Çok geniş çerçeveden bakılacak olursa monoklonal antikorlar vücuttaki tümör hücrelerini veya anormal hücreleri işaretlemek için kullanılıp, bağışıklık sistemi hücrelerinin bu anormal hücrelere saldırmasını sağlar. mAb üretiminin kalitesini ve kalitenin devamlılığını garanti etmek için protein ifadesinden depolama fazına kadar olan her süreç adımı iyi kontrol edilmeli ve analizleri yapılmalıdır. Monoklonal antikorların protein yapılarının analiz edilmesi, translasyon sonrası değişikliklerin kontrolünün sağlanması, bağlanma aktivitesi ve biyomoleküler ve hücresel fonksiyonlar dahil kritik kalite özellik seviyelerinin tanımlanması gerekmektedir. Bu çalışmada amaç, mAb gibi biyoteknolojik ilaçların biyoaktivitesini kısa sürede değerlendirmeyi sağlayan ve etiket gerektirmeyen yeni bir analiz yönteminin geliştirilmesidir. Bu amaçla Disipasyon İzlemeli Kuvars Kristal Mikrotekrazi (QCM-D) yöntemi model bir monoklonal antikorun biyoaktivitesinin gerçek zamanlı ve etiketsiz bir şekilde değerlendirilebilmesi için kullanılmıştır. Seçilen mAb'ın HER2 reseptörüne bağlanması dikkate alınarak, bu reseptörlerin yüksek miktarda bulunduğu insan yumurtalık adenokarsinomu (SKOV3) hücreleri kullanılmıştır. QCM-D tekniği, sensör yüzeyine tutunup yayılan hücre katmanının hem kütle miktarının hem de viskoelastik özelliklerinin karakterizasyonunun yapılmasını sağladığı için tercih edilmiştir. QCM-D yüzey-hücre arayüzeyindeki değişikliklere hassas olduğu için hücre hareketleri ve/veya hücre reorganizasyonda meydana gelen değişiklikler hem frekans (f) hem de disipasyon (D) değerlerinde değişikliklere yol açar. QCM-D sinyallerindeki frekans değişimi (Δf) kütle değişimini yansıtırken, disipasyon değişikliği (ΔD) viskoelastik özelliklerle ilişkilidir. Akustik oran (ΔD / Δf) ise her bir frekans değişimi başına disipasyon değişimini göstermekte olup sensör yüzeyindeki katmanın viskoelastik özelliği hakkında detaylı bir bilgi vermektedir. Bu şekilde ilacın bağlanması sonrası hücrede meydana gelen değişiklikler etiketleme olmadan gerçek zamanlı izlenebilmiş olur. Çalışmamızda öncelikle QCM-D deneylerinde kullanılan ilacın hücreler üzerindeki etkisini net bir şekilde görebilmek için çeşitli optimizasyonlar yapılmıştır. İlk olarak ilaç denemelerinde kullanılacak hücre sayısı ve hücrelerin inkübasyon koşulları ve inkübasyon süresi optimize edilmiştir. Hücre sayısı hücreler fikse edilip boyandıktan sonra floresan mikroskobu altında hücrelerin dağılımları ve konsantrasyonu incelenerek belirlenmiştir. Yapılan incelemeler sonucunda hücrelerin birbirlerine çok yakın olmadığı, yayılmalarının ve hareketlerinin kısıtlanmadığı en uygun hücre miktarı 0.5x105 hücre olarak belirlenmiştir. Serum proteinlerininin varlığı hücre bağlanma davranışını değiştirip QCM-D sinyalini ayırt etmeyi zorlaştırdığından ilaç bağlanma denemeleri serumsuz besi yeri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle hücrelerin serumsuz besi yerinde inkübe edilmesinin hücre morfolojileri üzerinde bir etkisinin olup olmadığı araştırılmıştır. Hücreler fikse edilip boyandıktan sonra morfolojilerinin incelenmesi sonucunda serumlu ve serumsuz ortamda inkübe edilen hücreler arasında önemli bir fark gözlenmemiştir. Son olarak da hücrelerin yüzeye ekildikten sonraki inkübasyon süreleri optimize edilmiştir. Bunun için hücreler sensör yüzeyine ekilip 15, 20 ve 24 saat inkübe edildikten sonra QCM-D deneylerine alınmıştır. QCM-D sinyallerindeki frekans, disipasyon ve akustik oran değişimleri incelenerek hücrelerin yüzeye tamamen yayıldığını gösteren 24 saat, inkübasyon süresi olarak belirlenmiştir. İlaç denemeleri için, üçüncü harmoniklerde hem frekans hem de disipasyon sinyallerinde dengeye ulaşıldığında HER2 monoklonal antikoru içeren besi yeri, QCM ölçüm odası dolana kadar odacığa pompa yardımıyla gönderilmiştir. İlaçlı besi yeri QCM odacığına ulaştıktan sonra akış durdurulup hücreler HER2 reseptörüne bağlanan monoklonal antikor ile belirli bir süre boyunca inkübe edilmiştir. QCM-D çalışmalarında, SKOV-3 hücrelerinin 40, 80, 120 ve 160 ug/mL konsantrasyonlarındaki HER2 reseptörüne bağlanan mAb'a karşı tepkileri analiz edilmiştir. İlaç denemeleri sonunda QCM-D frekans değerlerinde belirgin bir artış olurken, disipasyon sinyallerinde karakteristik bir azalma gözlenmiştir. Kontrol deneylerinin yani ilaçsız besi yeri ile inkübe edilen hücrelerin QCM-D sinyallerinde ise neredeyse hiçbir değişiklik gözlenmemiştir. Δf ve ΔD sinyallerindeki bu belirgin değişikliklere ek olarak, artan ilaç konsantrasyonu, hücrelerin viskoelastik özellikleri hakkında bilgi veren akustik oran (ΔD / Δf) değerinde de önemli bir düşüşe neden olmuştur. İlaç deneyleri sonucunda hücre morfolojilerinde ve yayılmasında meydana gelen değişikliklerin görsel olarak da incelenebilmesi için hücreler, hücre iskeletine etki eden Phalloidin boyası ile boyanmıştır. İlacın hücre morfolojisi üzerindeki etkisi 40 ug/mL ilaç konsantrasyonunda belirgin bir şekilde fark edilirken, ilaç konsantrasyonu arttıkça bu etki daha da yoğun bir şekilde gözlenmiştir. İlaçla muamele edilen hücrelerin morfolojileri kontrol hücrelerininki ile kıyaslandığında hücre şekilleri arasında önemli farklar gözlenmiştir. Kontrol hücrelerinin şekli daha yuvarlak ve hücre zarları daha düzgün iken ilaçla inkübe edilen hücrelerin hücre zarları daha kıvrımlı bir hale gelmiştir. Ayrıca ilaç ile inkübe edilen hücrelerin kenarları daha yoğun bir şekilde boyanmış gibi görünmektedir. Bu yoğun boyanmış alanların spesifik noktalarda artış göstermesi, hücre kenarlarındaki artan aktin filament konsantrasyonu ile açıklanabilir. Aktin filamentleri son derece dinamik olduğu için, ilacın SKOV3 hücrelerine bağlanması aktin filament konsantrasyonunun artmasına ve aktin filamentlerinin hücre kenarlarındaki dağılımınının değişmesine neden olmuş olabilir. Aktin filamentlerinin bu şekilde yeniden düzenlenmesi, hücrelerin daha rijid hale gelmesine ve hücrelerin hareket etmesine, yüzey üzerinde organizasyonlarını değiştirmelerine yol açmış olabilir. Hücrelerin morfolojilerindeki bu değişiklikler QCM-D sinyallerindeki değişimin nedeni de açıklamaktadır. Sonuç olarak, QCM-D sonuçları ve floresan mikroskopi görüntüleri monoklonal antikorun SKOV3 hücrelerine bağlanmasıyla hücre morfolojileri üzerinde önemli bir değişikliğe neden olduğunu göstermektedir Bu değişiklikler gerçek zamanlı ve etiketsiz olarak QCM-D ile takip edilebilmiştir. Bu yöntem izole edilmiş reseptörlerle ve etiketleme ile yapılan bağlanma analizleri yerine, reseptörün doğal ortamında yani hücre zarında bulunduğu haliyle kullanıldığı ve etiket gerektirmeyen biyoaktivite analizlerinde QCM-D'nin kullanılabileceği gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
There has been an exponential growth in the biotechnology industry which is resulted in the presence of more than hundreds of biotechnological molecules in several therapeutic areas. Biotechnological drugs differ in many ways from more common chemical drugs. For instance, chemical drugs are small and stable molecules that are produced by well-defined processes with chemical synthesis, but biopharmaceutical products are large and complex biomolecules with a heterogeneous structure. Unlike chemical drugs that are not or barely sensitive to process changes, biopharmaceuticals are tremendously sensitive to process changes, and they are prepared by using alive systems that modified using recombinant DNA technology, mainly bacteria, and mammalian cells. The largest group of biopharmaceuticals is monoclonal antibodies (mAbs). mAbs are presently utilized in many therapeutic areas for cancer therapies, cardiovascular diseases, inflammatory diseases, infections, organ transplantations, respiratory diseases, and ophthalmologic diseases. Each step from the protein expression to the final product in the mAb production processes should be robustly controlled in order to assure quality and consistency. Furthermore, the definition and profiling of critical quality properties, including the structure of mAb, post-translational modifications in the structure, the binding activity, and biomolecular and cellular level functions is required. In this study, the aim is to develop a label-free method to evaluate the bioactivity of mAb-based biotechnological drugs in a short duration. For this purpose, Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D) was selected for real-time, label-free bioactivity evaluation of HER2 targeted mAb on SKOV3 (human ovary adenocarcinoma) cells. Both frequency (f) and dissipation (D) values are affected by the changes in the cell-surface interface, e.g. viscoelasticity, cell movements, and/or cell reorganizations. To monitor these changes, first measurement parameters were optimized and then the change in signal as a result of mAb treatment was monitored in QCM-D. Interpretation of QCM-D data was also complemented with the examination of changes in cell morphology under the fluorescence microscope after the fixation and staining protocol. Before QCM-D studies, measurement conditions were optimized using different initial cell numbers, incubation conditions, and incubation time, and cell distributions were analyzed by cell staining under fluorescence microscope. In order to avoid cell stacking, the most suitable cell amount was determined as 0.5x105 cells for drug trials. To eliminate the interference that may be originated from serum proteins, drug trials were conducted in serum-free media. To see the effect of serum-free media on cells, the cells were fixed and stained, and no significant differences were observed between cell morphologies in different media conditions. Before drug trials, cells were incubated for 15, 20, and 24 hours after seeding to determine the most suitable incubation time. To allow cells to completely spread to surface, incubation time after seeding was determined as 24 hours. For drug trials, when the stable baseline for both frequency and dissipation at the third harmonics was obtained, media containing HER2-mAb was pumped to the measurement chamber until the whole chamber was filled and the cells were incubated with HER2-mAb under no-flow conditions. The response of SKOV-3 cells to HER2-mAb at different concentrations, i.e. 40, 80, 120, and 160 µg/mL were analyzed. While there was a noticeable increase in frequency, a characteristic decrease in dissipation was observed in drug treatment experiments. There was almost no change in QCM-D signals in control experiments in which no drug was used. In addition to those noticeable changes in Δf and ΔD signals, drug concentration also caused a significant change in acoustic ratio (ΔD/Δf) values which gives information about the viscoelastic properties of the cell layer. To visualize the cell morphologies and spreading, cells were stained with the Phalloidin dye acting on the cytoskeleton. The effect of the drug on the cell morphology becomes visible when 40 µg/mL drug was used, and intensity was more pronounced as concentration increased. When the morphology of the drug-treated cells compared to the control cells, a significant effect on the cell shapes can be observed. While the shape of the control cells was smooth, the cell membranes of the drug-treated cells become more curled. In addition, the edges of the cells incubated with the drug seem to be more intensely stained. This increase in intensity concentrated on specific points can be explained by the increased concentration of actin filaments at the cell edges. Actin filaments are very dynamic, so binding of the drug to SKOV3 cells may lead to increase actin filament concentration and change the distribution of actin filaments around the cell edges. These reorganizations of actin filaments would cause an increase in cell rigidity and this explains the decrease in dissipation values in QCM-D signals. In conclusion, both the QCM-D and fluorescent microscopy images showed that HER2-mAb binding triggers the change in morphology of the cells, and the changes in QCM-D signal can be used to design label-free, real-time novel bioactivity assays for biopharmaceuticals.
Benzer Tezler
- Yüzey aktif katyonlarla modifiye edilmiş Ünye bentonit ve tartrazin boyarmaddesi arasındaki etkileşimlerin XRD, TG/DTA, FTIR analiz tekniklerinin kullanılmasıyla ve adsorpsiyon verilerinin değerlendirilmesiyle incelenmesi
Investigation of interactions between cationic surfactants modified Unye bentonite and tartrazine dyestuff by using of XRD, TG/DTA, FTIR techniques and evaluation of adsorption data
HAŞİME PELTEK
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
KimyaRecep Tayyip Erdoğan ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AHMET TABAK
- Daptomisin kullanan hastaların dosyalarının incelenerek beraberinde kullandığı ilaçlarla etkileşiminin retrospektif olarak değerlendirilmesi
The evaluation of interference of drug interactions by retrospectively examining the files of the patients who use daptomycin
MURAT ÇALIŞKAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Eczacılık ve Farmakolojiİstanbul Medipol ÜniversitesiKlinik Eczacılık Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ÇAĞLAR MACİT
- Evaluation of cognitive performance of seafarers in heavy weather conditions using cognitive test software application
Gemi adamlarının bilişsel performanslarının bilişsel test yazılımı kullanarak ağır hava koşullarında değerlendirmesi
MESUT CAN KÖSEOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Denizcilikİstanbul Teknik ÜniversitesiDeniz Ulaştırma Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. LEYLA TAVACIOĞLU
- Piaget'nin zihinsel gelişim kuramına göre ilköğretim matematik dersi programının değerlendirilmesi
Evaluation of primary education mathematics cirriculum according to Piaget's intellectual development theory
LEVENT ÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
1996
Eğitim ve ÖğretimAfyon Kocatepe ÜniversitesiEğitim Programları ve Öğretimi Ana Bilim Dalı
PROF.DR. MUSTAFA ERGÜN
- Toplu konut alanlarında biçimsel yapının mekan dizimi yöntemiyle değerlendirilmesi: Eskişehir örneği
Evaluation of morphological structure in mass housing area by space syntax method: Eskişehir case
OSMAN TUTAL