Geri Dön

Cloning, production, purification, and characterization of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF)

Granülosit-koloni uyarıcı faktörü (G-CSF) klonlanması, üretimi, saflaştırma ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 659030
  2. Yazar: CANSIN KIRMAÇOĞLU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 106

Özet

Hemopoez, vücudun kırmızı ve beyaz kan hücreleri üretmesi sürecidir. Uzun süre canlı kalan Hemopoietik Kök Hücreleri (HKH) çeşitli kan hücrelerine farklılaşabileme yetenekleri olan özel hücrelerdir. HKH'dan farklılaşan ortak miyeloid progenitör hücreler, mast hücrelerine veya eozinofil, bazofil ve nötrofil adı verilen granülleri taşıyan granülosit hücrelerine farklılaşırlar. HKH'nın çeşitli kan hücrelerine farklılaşma süreci, interferon, interlökin ve büyüme faktörleri gibi sitokin adı verilen birçok küçük protein tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmektedir. Talep ve homeostaza bağlı olarak, farklı oranlarda farklı hücre hatları üretilir. Bu nedenle, her hücre tipinin kendilerini düzenleyen bir ya da birkaç sitokini vardır. Bu sitokinlere örnek olarak Koloni Uyarıcı Faktörler (CSF) olan Makrofaj CSF, Granülosit-Makrofaj CSF, Granülosit CSF ve Çoklu potansiyel-CSF verilebilir. Kan dolaşımındaki en bol lökositlerden olan nötrofiller, iltihaplanmaş ya da enfekte olmuş dokularda bakteri, virüs ve mantar gibi istilacılara karşı savaşan ilk savunma hücreleridir. Bu fagositoz kabiliyetleri olan hücreler benzersiz bir morfolojiye sahiptir. Çok-loblu çekirdekleri vardır ve birçok anti-bakteriyel enzimi, proteazları, nötrofillerin hareketine yönelik yardımcı proteinleri ve benzeri proteinleri taşıyan granüllere sahiptir. Yabancı hücreleri fagosit hücre içine alıp bu granüllerdeki enzimler ile veya süperoksit oluşumunu fagosom ile birleştirerek yabancı hücreleri yok ederler. Ayrıca, nötrofiller granülleri ve çevreye ekositoz yapabilirler. Üstelik, DNA'daki histon proteinleri benzeri nükleik asit proteinlerini ve DNA'nın kendisini ekositoz yaparak Nötrofil Hücre Tuzakları, NET'ler oluşturup; kendileri ölürken istilacıları NET'e tuzağa düşürüp başka hücreler tarafından yok edilmesini kolaylaştırırlar. Bu nedenle, doğal bağışıklık sisteminde rol alan son derecede önemli hücrelerden birisidir. Nötrofillerin HSC'lerden farklılaşması bir dizi sitokin tarafından güçlü bir şekilde modüle edilir, ancak bu sitokinlerin en önemlilerinden biri Granülosit Koloni Uyarıcı Faktördür (G-CSF). 4 -sarmallı ve 2 disülfit bağı olan G-CSF, 174 amino asitten oluşan ve bir O-glikosilasyona bölgesi barındıran küçük bir proteindir. Disülfit bağlarının her biri G-CSF'in biyolojik aktivitesi için önemlidir ancak Thr133 bölgesindeki glikolizlenmenin bu aktivite için önemi yokturç G-CSF bir sitokin reseptörü olan G-CSF reseptörü (G-CSFR) ile 2: 2 (ligand-reseptörü) stokiyometrisi ile dimerize olurç G-CSF reseptörü ile dimerleştiğinde, JNK / STAT, PI-3K / AKT ve Ras / MAPK gibi çeşitli sinyal yolakları aktive edilir. Bu yollarla, nötrofillerin hayatta kalması ve proliferasyonu artar, nötrofillerin progenitör hücrelerden gelişimi indüklenir ve kemik iliğinden kan dolaşımına göçleri uyarılır. Nötrofillerin yanı sıra, G-CSF'nün T hücreleri, dendritik hücreler, monositler gibi bağışıklık sistemi hücreleri ile nöronlar ve astronitler gibi sinir sistemi hücrelerinde, bazı hücrelerin üretimini destekleme, sitokin üretimini destekleme nöropoezi destekleme gibi çeşitli süreçler üzerinde bir rolü bulunmaktadır. Homeostaza göre sıkı bir şekilde kontrol edilmesine rağmen, nötrofillerin miktarları belirli koşullar nedeniyle normal durumdan daha düşük olabilir. Vücuttaki bu anormal düşük sayıdaki nötrofil durumu klinik olarak nötropeni olarak adlandırılmıştır. Nötropeni ağır konjenital nötropeni (AKN) gibi ana hastalık olabilir veya ilaca bağlı nötropeni ve kemoterapiye bağlı nötropeni gibi asıl bir hastalıktan sonra ikincil bir hastalık olarak geliştirilebilir. Üstelik bazen nötropeni yüksek ateş ile de görülebilir. Her durumda, nötropeni, vücut bir enflamasyon ya da enfeksiyon ile karşı karşıya kaldığında anlık koruma sağlayan doğuştan gelen bağışıklık sisteminde bozukluklara neden olur çünkü işgalcileri yok etmek için yeterli fagositotik nötrofil hücreleri vücutta bulunmamaktadır. Hematopoetik büyüme faktörlerinin olgunlaşmış kan hücrelerinde ve hematopoietik kök hücrelerdeki etkileri rekombinant olarak izole edilip açıklanmaya başlayınca bilim insanları onları tedavi olarak kullanmaya da başladılar. Bu klonlama ile tedavi olarak günümüzde de kullanılan büyüme faktörlerinden biri de 1991 yılında FDA tarafından onaylanan ve Amerika Birleşik Devletleri'nde Filgrastrim adıyla bilinen G-CSF'tir. Bu tedavi ilk olarak kemoterapi alan ve daha sonra nötropeni geliştiren hastalar için kullanılmış ve günümüzde azalan nötrofil ile ilgili birçok hastalığa karşı önemli bir tedavi haline gelmiştir. Bu nedenle filgrastim, küresel olarak birçok biyobenzerine sahip olan ana biyolojik ilaçlardan biridir. Yukarıdaki açıklamalar doğrultusunda, bu tez insan beyni glial U87-MG hücre hattından insan G-CSF sekansını elde etmeyi ve prokaryotik sistemler için pET-30a (+):: hG-CSF plazmidini oluşturmayı amaçlamıştır. Bir E. coli suşu, BL21 (DE3) kullanılarak hG-CSF'nin üretimi ve ÄKTA Avant kromatografi sistemlerinde basit bir yöntemle inklüzyon cisimciklerinden saflaştırılması diğer hedeflerdir. Ayrıca peptit haritalama, dekonvolut kütle analizi, kapiler elektroforez, SEC-HPLC, sirküler dikroizm ve konak hücre protein tahlil yöntemleri ile G-CSF'nin kimliğini ve saflığını referans ürünle doğrulamayı ve karşılaştırmak amaçlanmıştır. Bu amaçla, ilk önce U87-MG hücrelerinin RNA izole edilmiş ve başarıyla izole edilen RNA'lar cDNA'ya çevrilmiştir. Bu cDNA'lerden elde edilen hG-CSF geni pET30a (+) vektörünün içine başarıyla klonlanmış, sonuç olarak bakteri sistemlerinde kullanılacak bir bir pET-30a (+)::hG-CSF plazmidi oluşturulmuştur. E. coli BL21 (DE3) suşu, IPTG indüksiyonlu üretim için konakçı olarak seçilmiş ve transforme edilmiştir. pET-30a (+)::hG-CSF plazmidi içeren hücreler için en iyi büyüme koşulları belirlenmiştir. Bu deneyler ayrıca hG-CSF'nin hücre lizatındaki inklüzyon cisimciklerinde kaldığını da göstermiştir. Bu nedenle, daha sonra pellette kalan inklüzyon cisimcikleri yıkama tamponu ile yıkanmış, çözündürme tamponuyla çözünmüş ve daha sonra diyalizle yeniden katlanmıştır. Hedef proteinin protein lizatından saflaştırılması katyon değişim kromatografisi ile yapılmış, analizi sodyum dodesil sülfat jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve hedef proteinin tespiti immünoblotlama teknikleriyle yapılmıştır. Saflaştırılan hedef proteinin moleküler ağırlık tahmini ve referans ürünle moleküler ağırlık karşılaştırması LC -MS yoluyla intakt kütle analizi metodu ile gerçekleştirilmiştir. Bu analize göre, hG-CSF ve referans ürün 18800 Da moleküler ağırlığa sahip monomer proteinlerdir. Saflaştırılmış hedef proteinin birincil yapısı, LC-MS / MS üzerinde peptid haritalama analizi ile elde edilmiştir. Sonuç olarak, SV-8 Glu-C enzim ile kesilen hGCSF ve referansın aynı amino asit sekansina sahip olduğu görülmüştür. Öte yandan, hem referans proteinin hem de saflaştırılmış hG-CSF'nin ikincil yapısı sirküler dikroizm (CD) ile far-UV (% 95 saflığa sahip olduğunu göstermiştir. Her iki proteinin, çözelti içinde monomer olarak var olduğunu gösterilmiştir. E. coli konak hücre proteini ELISA tayini ile G-CSF ürününde önemli bir konakçı hücre proteini kalmadığı gösterilmiştir. G-CSF'mizin biyolojik işlevi, insan monositik hücresi THP-1 üzerinde fosforilasyon ile MAPK yolağındaki proteinlerden biri olan Hücre Dışı sinyalle düzenlenen kinaz 1/2 (ERK) aktivasyonunun belirlenmesi yoluyla test edilir. Bu deney sonucunda G-CSF ürünü, MAPK'yı aktive eder ve aktif bir proteindir. Karakterizasyonu tamamlanan G-CSF ürününün biyolojik işlevi, insan monositik hücresi THP-1 üzerinde, MAPK yolağındaki proteinlerden biri olan ekstraselüler sinyalle düzenlenen kinaz 1/2 (ERK) fosforilasyonla aktivasyonunun belirlenmesi yoluyla test edilmiştir. Bu deney sonucunda G-CSF ürünümüzün stimülasyonu ile THP-1 hücrelerindeki p-ERK miktarı artmıştır. Sonuç olarak kendisinin aktif bir protein olduğu gözlemlenmiştir. Bu deneylerin sonucunda, filgrastim ilacının ana maddesi olan hG-CSF için kullanılan klonma ve saflaştırma başarılı olmuş, son ürünün katlanmış halini koruduğu ve referans ürün ile olan benzerliği karakterizasyon teknikleri ile gösterilmiştir, biyolojik fonksiyonu test edilmiştir.

Özet (Çeviri)

Hematopoiesis is a crucial process for producing white blood cells in the body. Hemopoietic Stem Cells (HSC) differentiate into a variety of blood cells. The common myeloid progenitor cells, which are destined from HSC, differentiate into mast cells as well as granule carrying granulocytes called an eosinophil, basophil, and neutrophil. The differentiation process of HSC to a variety of blood cells is strictly regulated by many small proteins called cytokines; such as interferon, interleukin, and growth factors. Generation of different cells lines at different rates is depending on the cellular demand and homeostasis. Therefore, each cell has some unique cytokine that maintain its homeostasis; for instance, Colony Stimulating Factors (CSF): Macrophage CSF, Granulocyte-Macrophage CSF, Granulocyte CSF, and Multi potential-CSF, and IL-3. Neutrophils, the most abundant type of leukocytes in the circulation, are the first cells that arrive at the inflamed or the infected tissue and fight against the invaders such as bacteria, viruses, and fungi. These phagocytic cells have unique morphology: they have lobulated nuclei and granules that carry many anti-bacterial enzymes, proteases, proteins to assist movement of the neutrophils. They phagocyte the foreign cells and destroy them by either using those granules or forming superoxide radicals. Besides, neutrophils destroy them by exocytosing them or their proteins such as DNA proteins granules to the environment. Furthermore, granules and these proteins may form Neutrophil Extracellular Traps (NETs) to trap invaders. Therefore, they are significantly essential in innate immunity. Differentiation of neutrophils from HSCs is strongly modulated by a number of cytokines, yet one of the most important of these cytokines is Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF). It is a small mature protein composed of 174 amino-acids with 4 -helixes and 2 disulfide bonds and harbors an O-glycosylation site. Each of the disulfide bonds are required for the biological activity of G-CSF. G-CSF dimerizes with a cytokine receptor, G-CSF receptor (G-CSFR), with a stoichiometry of 2:2 (ligand-receptor). When G-CSF dimerizes with its receptor, a number of signaling pathways including JNK/STAT, PI-3K/AKT, and Ras/MAPK are activated. By those pathways, survival and proliferation of neutrophils is increased, development of neutrophils from progenitor cells are induced, and their migration towards blood circulation from the bone marrow is stimulated. On the other hand, suppressor of cytokine signaling 3, SOC3, is a negative regulator of the G-CSF signaling pathway. In addition to neutrophils, G-CSF has an impact on immune system cells such as T-cells, dendritic cells, monocytes. In addition to this, they also have an impact on nervous system cells such as neurons, astrocytes on various processes, as in the case of regulating TREG cell and Type II dendritic cell production, cytokine production, and neuropoiesis, respectively. Although there is a strictly controlled homeostasis of neutrophils, their levels in blood might be low in particular conditions. This abnormally low number of neutrophils in the body has been clinically named as neutropenia. Neutropenia can be the main disease, such as severe congenital neutropenia, or may develop as a secondary outcome due to a disease such as drug-induced neutropenia and chemotherapy-induced neutropenia. Moreover, sometimes neutropenia can be seen with elevated fever, in other words, febrile neutropenia. Either way, neutropenia causes failure of innate immunity when the body faces an infection or inflammation since there are not sufficient neutrophils to destroy invaders. After, scientists have cloned recombinant human growth factors and elucidated their significant roles for the production of blood cells from progenitors, growth factors started to be used in treatment of hemopoietic diseases. One of those growth factors, which has been used as a therapy since 1991 by the approval of FDA, is G-CSF or in its well-known name, filgrastim in the US. This treatment was firstly used for the patients receiving chemotherapy and then developed neutropenia, which is a disease that could affect the duration and severity of chemotherapy of the patients. Therefore, filgrastim is one of the main biologic medicines which has many biosimilars globally In line with the above explanations, this thesis aimed to obtain active human G-CSF from human brain glial U87-MG cell line and construct the pET-30a(+)::hG-CSF plasmid for prokaryotic systems. The production of hG-CSF using a Escherichia coli strain, BL21 (DE3) and purification of it from inclusion bodies by a simple method in ÄKTA Avant chromatography systems were other goals. We also intended to confirm and compare the identity and purity of G-CSF with the reference product by peptide mapping, intact mass analysis, capillary electrophoresis, SEC-HPLC, circular dichroism and host cell protein assay methods. For this purpose, the G-CSF gene CSF3 has been cloned from the brain glioblastoma U87-MG cells, placed into the pET-30a(+) cloning vector and in conclusion created a pET-30a(+) ::hG-CSF plasmid. E. coli BL21(DE3) strain has selected as the host for the production with IPTG induction. The best growth conditions for this cell strain with pET-30a(+) ::hG-CSF plasmid has been determined. This experiment has also shown that hG-CSF stays at the inclusion bodies in the cell lysate. Thereafter, inclusion bodies have been washed with wash buffer, solubilized with solubilization buffer and refolded with step-wise dialysis afterwards. The purification of target protein from protein lysate is achieved by cation exchange chromatography while analyzed by sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the detection of the target protein is analyzed by immunoblotting techniques. The molecular weight estimation and comparison with the reference product is achieved with intact mass analysis via LC/MS. According to this analysis, both monomer recombinant hG-CSF is similar to reference product. The primary structure of the purified target protein is achieved by peptide mapping analysis on LC-MS/MS. As a result, SV-8 GLU-C and digested h-GCSF and reference has same primary structure. On the other hand, secondary structure of both reference protein and purified hG-CSF was analyzed by Circular Dichroism (CD). The two spectra appeared to be the same and represented an alpha-helix rich structure. Then, oligomeric state of both reference protein and G-CSF was detected by high-performance liquid size exclusion chromatography (HPLC-SEC) and indicated that both proteins exist as monomer in solution. On the other hand, HPLC SEC is used for concentration determination, which is estimated as 0.1 mg/ml per growth. CE-SDS showed that our G-CSF has >95% p Host cell protein ELISA shows that, there is no significant host cell protein remained in the final G-CSF product. The biological function of our G-CSF is tested via determination of activation of one of the proteins on the MAPK pathway, Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK), by phosphorylation on human monocytic cell, THP-1. As a result of this experiment, G-CSF product, activates the MAPK and it is an active protein. As a result of these experiments, the cloning and purification used for hG-CSF, the main ingredient of the filgrastim drug, was successful. It was shown that the final product retained its folded form and its similarity with the reference product was demonstrated by characterization technique. Also, its biological function was tested.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    505859

    Kan kanseri tedavisinde sıklıkla kullanılan insan hematopoetik büyüme faktörlerinden G-CSF ve GM-CSF'ün rekombinant olarak üretilmesi saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Production, purification and characterization of recombinant human hematopoietic growth factors such as G-CSF and GM-CSF which are frequently used in leukemia treatment

    YASEMİN BOZKURT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyomühendislikGaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SEÇİL ERDEN TAYHAN

  2. Tez No

    376235

    İnsan Paraoksonaz 1 (pon1) geninin klonlanması, Pichia pastoris'te ekspresyonu, Rekombinant enzimin saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Human Paraoxonase 1 (pon1) gene cloning, expression in Pichia pastoris, purification and characterization of Recombinant enzyme

    YAĞMUR ÜNVER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    BiyoteknolojiAtatürk Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ESABİ BAŞARAN KURBANOĞLU

    PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN

  3. Tez No

    865828

    Termofilik Anoxybacillus ayderensis ksilanazının klonlanması, üretimi, saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu

    Clonig, production, purification, and biochemical characterization of thermophilic xylanase from Anoxybacillus ayderensis

    ZÜLEYHA AKPINAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyokimyaRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Su Ürünleri Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU

  4. Tez No

    713928

    Expression, purification, and characterization of recombinant human IL-2

    Rekombinant insan IL-2'nin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    BUSE AKGÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  5. Tez No

    276957

    Isolation and identification of lipase producing soil fungus; Cloning, sequencing and partial characterization of its lipase

    Lipaz üreten toprak kaynaklı küfün izolasyonu ve tanımlanması; Lipazın klonlanması, sekans analizinin yapılması ve kısmi karakterizasyonu

    ELVAN ERGÜLEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. ALPER ARSLANOĞLU

Geri Dön