Geri Dön

Extracellular expression of Ideonella sakaiensis PETase mutant in photosynthetic microalga Chlorella vulgaris

Ideonella sakaiensis PETase mutantının fotosentetik mikroalg Chlorella vulgaris'de hücre dışı ekspresyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 665246
  2. Yazar: MEHMET EL
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ UĞUR UZUNER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Karadeniz Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 77

Özet

PETaz enzimi polietilen terefitalat (PET) türevi plastiklerin hidrolizinden sorumlu temel enzim olarak 2017 yılında ilk kez tanımlanmıştır. İki farklı çalışmada belirlenmiş ve yüksek oranda aktivite artışı sağlamış en yüksek aktiviteli 3 farklı mutasyon belirlenmiş ve bunların kümülatif aktivite artışı durumları in silico modelleme ve moleküler kenetleme analizleri üzerinden dğrulandıktan sonra tek bir PETaz sekansında birleştirilmiştir. Oluşturulan PETaz nükleotit dizisi, sentetik olarak ticari yollardan sentezlendi ve PETaz3M olarak adlandırıldı. PCR yoluyla çoğaltılarak, pJET1.2 klonlama vektörüne klonlandı. PETaz3M'i kodlayan nükleotit bölgesi, mikroalg ifade vektörü pOPT_cCa_mRuby2_Paromy'e aktarıldı. PETaz3M kodlayıcı DNA fragmanı, HSP70/RBCS2 füzyon promotor'un arkasına yerleştirildi. pOPT_cCa_mRuby2_Paromy vektöründe bulunan Kırmızı Floresan Proteinini (RFP) kodlayan bölge, BglII ve EcoRI enzimleriyle kesilerek çıkarıldı ve PETaz3M kodlayıcı DNA fragmanının bu bölgeye ligasyonu sağlandı. Böylece, PETaz3M kodlayan bölge, HSP70/RBCS2 promotoru ve 3' translasyona uğramayan bölge (3'UTR) arasına entegre edilerek, mikroalg konaklarına transformasyon için hazırlandı. pOpt_cCA_mRuby2_Paro_PETaz3M vektörünün C. vulgaris hücrelerine transformasyonu elektroporasyonla gerçekleştirildi. PETaz3M pozitif transformantlar, 50 µg/ml paromomisin içeren TAP besiyerinde üç ardışık nesil boyunca seçime tabi tutuldu. C. vulgaris transformantları'nın hücre dışı ekspresyonu, SDS-PAGE ile doğrulandı. PETase3M enziminin fonksiyonelliği, saflaştırılmış PETase3M ile muamele edilmiş PET filmlerinin ışık mikroskobu altında yüzey analizleri yapılarak doğrulandı. Sonuç olarak, bu çalışma ile bir PETaz mutantının, ekstrem şartlara toleranslı C. vulgaris konaklarında hücre dışı üretimi ilk kez gerçekleştirildi.

Özet (Çeviri)

The first PET degrading enzyme was first identified in 2017. Subsequently, various enzyme engineering studies were carried out on PETase enzyme. Three different mutations were determined from two different studies with high activity improvement, and combined within one PETase aa sequence. After being evaluated through in silico modeling and molecular docking analysis, their integration into the encoding nucleotide sequence of PETase enzyme was performed. Subsequently, the newly created PETase DNA fragment was commercially synthesized as a synthetic gene and called as PETase3M. Upon PCR amplification, PETase3M was cloned into the pJET1.2 cloning vector for long term maintenance. The corresponding DNa fragment of PETase3M enzyme was transferred into the expression vector pOPT_cCA_mRuby2_Paromy for expression in microalgae hosts. In this vector, PETase3M DNA fragment was positioned behind the HSP70/RBCS2 fusion promoter system. For this task, native DNA region encoding Red Fluorescent Protein (RFP) in pOPT_cCA_mRuby2_Paromy vector was removed using BglII and EcoRI restriction enzymes, and the DNA fragment of PETaz3M was ligated into this place. In this way, the DNA fragment encoding PETase3M was integrated between HSP70/RBCS2 promoter and the 3' untranslated region (3'UTR), making it ready for transformation into eukaryotic microalgae. Transformation of C. vulgaris microalgae cells with recombinant pOPT_cCA_mRuby2_Paromy_PETase3M vector was performed by a modified electroporation process. PETase3M positive transformants of C. vulgaris 211/11J cells were selected for three consecutive generations on TAP agar containing 50 µg/ml paromomycin. The presence of PETase3M insert within microalgae nuclear genome was confirmed through the amplification of PETase3M gene by PCR. Upon His tag based prufıication, the successful and extracellular expression of recombinant PETase3M in C. vulgaris transformants was confirmed by SDS-PAGE analysis of microalgae culture medium. PET films treated with purified PETase3M and degraded to a certain degree under light microscopy. In conclusion, extracellular and functional production of a PETase3M mutant was carried out in C. vulgaris with high tolerance to extreme conditions for the first time. Thus, the devloped microalgae strain could find extensive utilizations in large-scale bioremediation and recycling applications of environmental PET wastes photosynthetically.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    409714

    Zeytin (Olea europaea L.) beta-glukozidaz geninin pichia pastoris'te hücre dışı ifadesi

    Extracellular expression of Olive (Olea europaea) beta-glucosidase gene in pichia pastoris

    SERPİL DEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyoteknolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ŞENAY VURAL KORKUT

  2. Tez No

    847253

    Extracellular production of recombinant microbial transglutaminase enzyme in Pichia pastoris

    Rekombinant mikrobiyal transglutaminaz enziminin Pichia pastoris'te hücre dışı üretimi

    LEYLA NUR KORKMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYSUN ÖZÇELİK

  3. Tez No

    389326

    Construction of expression vectors for the heterologous production of kpkt killer toxin in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris cells

    Kpkt katil toksininin Saccharomyces cerevisiae ve Pichia pastoris hücrelerinde heterolog üretimi için ekspresyon vektörlerinin oluşturulması

    MURAT ÜSTÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    201695

    Extracellular recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris

    Pichia pastoris ile hücredışı insan büyüme hormonu üretimi

    MEHMET ALİ ORMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2007

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER H. ÖZDAMAR

  5. Tez No

    316208

    Pichia pastoris alkol oksidaz (AOX1 ve AOX2) genlerinin inaktif edilmesi ve elde edilen suşun rekombinant protein üretiminde kullanılması

    Inactivation of alcohol oxidase genes (AOX1 and AOX2) in Pichia pastoris and utilization of the AOX-defective strain in recombinant protein production

    MERT KARAOĞLAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Gıda MühendisliğiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHMET İNAN

Geri Dön