Purification and characterization of cytochrome P4501A1 and cytochrome P450 reductase from feral leaping mullet (Liza salines) liver microsoms
Sitokrom P4501A1 ve P450 redüktazın doğal kefal balığı karaciğerinden saflaştırılması ve karakterizasyonu
- Tez No: 68363
- Danışmanlar: PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Sitokrom P4501A1, saflaştırma, karakterizasyon, kefal {Liza saliens), mavraki, monooksijenazlar, NADPH-sitokrom P450 redüktaz, 7-etoksirezorufin O-deetilaz (EROD). vı, Cytochrome P4501A1, purification, characterization, leaping mullet (Liza saliens), monooxygenases, NADPH-cytochrome P450 reductase, 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) IV
- Yıl: 1997
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 168
Özet
öz SİTOKROM P4501A1 VE P450 REDÜKTAZIN DOĞAL KEFAL BALIĞI KARACİĞERİNDEN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU ŞEN, Alaattin Doktora, Biyokimya Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Emel ARINÇ Ocak 1997, 151 sayfa Bu çalışmada, Izmir körfezinden toplanan doğal kefal (marvaki) balığının karaciğerinden sitokrom P4501A1 ve sitokrom P450 redüktaz homojen olarak saflaştınldı. Sitokrom P4501Al'in saflaştınlması, Emulgen 913 ve kolat ile çözünürleştirilmiş mikrozomlann iyon değişim kolon kromatografisi (birinci ve ikinci DEAE-selüloz), hidrofobik interaksiyon kolon kromatografisi, ( Porapak Q ve fenil-Sefaroz CL-4B) ve adsorpsiyon kolon kromatografisi (Hidroksilapatit) ile sağlandı. Saflaştınlan P4501A1 üçüncü DEAE-selüloz kolonu ile konsantre edildi. Sitokrom P4501A1 spektral, elektroforetik, biyokatalitik, ve immunokimyasal özellikleri incelenerek karakterize edildi. 32 Kez saflaştınlan ve özgül miktarı 15-17 nmol/mg protein olarak bulunan sitokrom P4501A1, SDS-poliakrilamit jel elektroforezin de moleküler ağırlığı 58000 ± 500 olan tek bir bant gösterdi. Mutlak spektrumu 417.5nm de, ditiyonit ile indirgenmiş CO-fark spektrumu 448nm dalga boylannda absorbans tepecikleri verdi. Saflaştınlan P4501A1 sentetik lipit ve balık karaciğer P450 redüktaz enzimi ile yeniden oluşturulan mikrozomal monooksijenaz sisteminde 7-etoksirezorufin O-deetilasyonunda aktif olmasına ragmen bilinen diğer monooksijenaz izozimlerinin substratlannı (benzfetamin ve anilin gibi) metabolizeetmedi. Kefal karaciğer mikrozomlanndan elde edilen sitokrom P4501A1 scup, alabalık ve cod gibi diğer teleost türlerinden saflaştırılan P4501A1 homologlarına karşı üretilen antikorlarla reaksiyon verdi. Spektral, elektroforetik, biyokatalitik, ve immunokimyasal özellikleri kefal karaciğerinden saflaştınlan sitokrom P450'nin P4501A1 izozimi olduğunu gösterdi. NADPH'ye bağlı sitokrom P450 redüktaz enzimi, 438-kez ve mikrozomlara oranla %17.5 verimle kefal karciğerinden saflaştınldı. Özgül aktivitesi 52.6 umol/dak/mg protein olarak saptandı. Enzimin moleküler ağırlığı SDS-poliakrilamit jel elektroforezinde 77000 ± 1000 olarak bulundu. Kefal karaciğer sitokrom P450 redüktaz enziminin mutlak spektrumu 378 ve 455nm dalga boylarında flavoproteinlere özgü olan iki tepecik gösterdi. Enzimin görünen Km değeri sitokrom c için 7.69 uM olarak saptandı ve enzimin 70 uM ve üzerindeki sitokrom c konsantrasyonlarında tamamen doymuş olduğu gözlendi. Bunlara ek olarak, enzimin biyokatalitik olarak aktif olduğu saptandı. Bütün bu sonuçlar saflaştınlan kefal karaciğer sitokrom P450 redüktaz'ın memeli P450 redüktazlanna spektral, elektroforetik ve biyokatalitik olarak benzer olduğunu gösterdi.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CYTOCHROME P4501A1 AND P450 REDUCTASE FROM FERAL LEAPING MULLET {LIZA SALIENS) LIVER MICROSOMES ŞEN, Alaattin Ph. D., Department of Biochemistry Supervisor: Prof. Dr. Emel ARINÇ January 1997, 151 pages In this study, cytochrome P4501A1 and cytochrome P450 reductase were purified to electrophoretic homogeneity from the liver microsomes of feral fish leaping mullet {Liza saliens) collected in İzmir Bay, Aegean coast of Turkey. Purification of cytochrome P4501A1 involved anion exchange chromatography of Emulgen 913-cholate solubilized microsomes on first- and second-DEAE-cellulose columns, hydrophobic interaction chromatographies of the partially purified cytochrome P4501A1 on Porapak Q and phenyl-Sepharose CL-4B and further purification on adsorption chromatography on the hydroxylapatite column. Finally, it is further concentrated and purified on third DEAE-cellulose column chromatography. It was characterized with respect to spectral, electrophoretic, immunochemical and biocatalytic properties. Cytochrome P4501 Al, purified 32-fold with a specific content of 15-17 nmoles P450 per mg protein, produced a single band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis having monomer molecular weight of 58000 ± 500. Absolute absorption spectrum of the purified cytochrome P4501A1 fractions showed maximal absorption at 417.5nm and CO- diff erence spectrum of dithionite-reduced cytochrome P4501A1 gave a peak at 448nm. Purified P4501A1 was found to be active in the O-deethylation of m7-ethoxyresorufin in the reconstituted system containing purified fish liver cytochrome P450 reductase and synthetic lipid. However, it was unable to catalyze the oxidation of the other monooxygenase substrates such as benzphetamine and aniline known to be specific for the other isozymes. Purified Liza saliens liver microsomal cytochrome P4501A1 showed strong cross-reactivity with the antibodies directed against the cytochrome P4501A1 homologues purified from other teleost species such as rainbow trout, scup and cod. Spectral, electrophoretic, immunochemical and biocatalytic properties of the purified cytochrome P4501A1 strongly suggested that it is the CYP1 Al in the Liza saliens liver. NADPH-cytochrome P450 reductase was purified 438-fold with a yield of 17.5% with respect to the initial amount present in the fish liver microsomes. The specific activity of the enzyme was found to be 52.6 umol cytochrome c reduced per minute per mg protein. The monomer molecular weight of the purified enzyme was calculated to be 77000 ± 1000 when subjected to electrophoresis on SDS-PAGE. The absorption spectrum of fish reductase showed two peaks at 378nm and 455nm. NADPH-dependent cytochrome c reductase activity of the purified Liza saliens liver cytochrome P450 reductase was found to be maximal when pH was between 7.4-7.8. The apparent Km of the purified enzyme was found to be 7.69 uM for cytochrome c when the enzyme activity was measured in 0.3 M potassium phosphate buffer, pH 7.7 at room temperature and the enzyme was fully saturated by its substrate, cytochrome c, when the substrate concentration at or above the 70 uM. Furthermore, the purified enzyme was found to be biocatalytically active. These results suggested that the purified fish liver cytochrome P450 reductase is similar to its mammalian counterparts with respect to spectral, electrophoretic and biocatalytic properties.
Benzer Tezler
- Purification and characterization of cytochrome b5 from sheep liver microsomes
Sitokrom b5'in koyun karaciğerinden saflaştırılması ve karakterizasyonu
DENİZ YALÇIN
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Purification and characterization of two fractions of cytochrome b5 from sheep lung
İki sitokrom b5 franksiyonunun koyun akciğerinden saflaştırılması ve karekterizasyonu
NİLAY BAŞARAN
Doktora
İngilizce
1994
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Partial purification and characterization of NADH-cytochrame b5 reductase from mullet liver microsomes
NADH-sitokrom b5 redüktaz enziminin kefal karaciğer mikroorganizmalarından kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu
ZAHİDE KABAKLAR
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Nadph-sitokrom P450 redüktaz enziminin Van Gölü balığı karaciğer mikrozomlarından saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı kimyasal maddelerin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification and characterization of nadph-cytochrome P450 reductase from Van Lake fish liver microsomes and investigation of some chemical substances? effects on the enzyme activity
MÜSLÜM KUZU
- Hindi Karaciğerinden NADPH-Sitokrom P450 Redüktaz Enziminin Saflaştırılması, Karakterizasyonu ve Bazı Kimyasal Maddelerin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkilerinin İncelenmesi
Purification and Characterization of NADPH Cytochrome P450 Reductase Enzyme from Turkey Liver and Investigation of The Effects of Some Chemical Substances on Enzyme Activity
EBRU AKKEMİK
