Purification and characterization of cytochrome b5 from sheep liver microsomes
Sitokrom b5'in koyun karaciğerinden saflaştırılması ve karakterizasyonu
- Tez No: 75735
- Danışmanlar: PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Sitokrom b5, saflaştırma, kısmi saflaştırma, karakterizasyon, koyun karaciğeri, NADH-sitokrom b5 redüktaz. VI, Cytochrome b5, purification, partial purification, characterization, sheep liver, NADH-cytochrome b5 reductase. IV
- Yıl: 1998
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 102
Özet
öz SİTOKROM b5' İN KOYUN KARACİĞERİNDEN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU YALÇIN, Deniz Yüksek Lisans, Biyokimya Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Emel ARINÇ Ocak 1998, 87 sayfa Bu çalışmada, sitokrom b5 koyun karaciğer mikrozomlarından homojen ve biyokatalitik olarak aktif bir şekilde saflaştırıldı. Spektral, elektroforetik, kinetik özellikleri ve moleküler ağırlığı incelenerek karakterize edildi. Sitokrom b5 redüktaz enzimi de koyun karaciğer mikrozomlarından kısmi olarak saflaştırılıp, sitokrom b5' in biyokatalitik özelliklerinin tespit edilmesinde kullanıldı. Sitokrom b5' in saflaştırılması, Emulgen 913 ve kolat ile çözünürleştirilmiş mikrozomların iyon değişim kolon kromatografisi, (birinci, ikinci ve üçüncü DEAE-sellüloz), ve Sephadex G-100 kolon kromatografisi ile sağlandı. 54 kez saflaştırılan ve özgül miktarı 41.3 nmol/mg protein olarak bulunan sitokrom b5, SDS-poliakrilamit jel elektroforezinde moleküler ağırlığı 16200±500 olan tek bant gösterdi. Mutlak spekturumu 412 nm de, ditiyonit ile indirgenmiş spektrumu 557,526.5 ve 423 dalga boylarında absorbans tepecikleri verdi. Sitokrom b5' in NADH- sitokrom b5 redüktaz enziminden sitokrom c' ye elektron transfer etme özelliği çalışılarak biokatalitik özellikleri tespit edildi. Km ve Vmaks değerleri 0.088 uM sitokrom b5 ve 315.8 umol/dak/mg enzim olarak bulundu. Sitokrom b5'in kendi enzimi tarafından indirgenmesi de çalışıldı ve Km ve Vmaks değerleri 5 uM sitokrom b5, 5200 nmol/dak/mg enzim olarak tespit edildi. NADH' e bağlı sitokrom b5 redüktaz enzimi 144 kez saflaştırılarak, özgül aktivitesi 670 umol/dak/mg enzim olarak saptandı. Kısmi olarak saflaştırılan sitokrom b5 redüktazın SDS-poliakrilamit jel elektroforezi iki bant verdi, moleküler ağırlığı 34000±200 olan bant NADH-sitokrom b5 redüktazın ağırlığı olarak kabul edildi. Kısmi olarak saflaştırılan koyun karaciğer sitokrom b5 redüktazın NADH-ferrisiyanit aktivitesinin pH 6.8-7.5 arasında maximum aktivite verdiği görüldü. K,,, ve Vraaks değerleri ise 0.024 mM ferrisiyanit ve 673 umol/dak/mg olarak bulundu. Kofaktör konsantrasyonun enzim aktivitesi üzerindeki etkileri çalışılarak Km ve Vmaks değerleri 0.02 mM NADH ve 699 umol/dak/mg enzim olarak bulundu.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CYTOCHROME b5 FROM SHEEP LIVER MICROSOMES YALÇIN, Deniz M.Sc, Department of Biochemistry Supervisor: Prof. Dr. Emel ARINÇ January 1998, 87 pages In this study, cytochrome b5 from sheep liver microsomes was purified in homogenous and biocatalytically active form and characterized in terms of spectral and kinetic properties and monomer molecular weight. Cytochrome b5 reductase was also purified partially from sheep liver microsomes to use it in determination of biocatalytic properties of cytochrome b5. Purification of cytochrome b5 involved anion exchange chromatography of Emulgen 913-Na cholate solubilized microsomes on first, second and third DEAE- cellulose columns and further purification on Sephadex G-100 column. Cytochrome b5 was purified 54-fold with a specific content of 41.3 nmoles b5 per mg protein, produced a single band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis having monomer molecular weight of 16200+500. Absolute absorption spectrumof the purified cytochrome b5 showed maximal absorption at 412 ran and dithionite-reduced cytochrome b5 gave peaks at 557, 526.5 and 423 ran. The ability of cytochrome b5 to transfer electrons from NADH-cytochrome b5 reductase to cytochrome c was investigated to determine biocatalytic properties. The K,,, and Vmax values were found as 0.088 uM cytochrome b5 and 315.8 umol cytochrome c reduced per minute per mg enzyme. Also the reduction of cytochrome b5 by its enzyme was studied and K,,, and Vmax values were determined to be 5 uM cytochrome b5 and 5200 nmol cytochrome b5 reduced per minute per mg enzyme. NADH-cytochrome b5 reductase was purified 144-fold with a specific activity of 670 umol ferricyanide reduced per minute per mg enzyme. Partially purified cytochrome b5 reductase gave two bands on SDS-PAGE. The one having the monomer molecular weight of 34000±200 accepted as a monomer molecular weight of sheep liver NADH-cytochrome b5 reductase. NADH-ferricyanide activity of the partially purified sheep liver cytochrome b5 reductase was found to be maximal when pH was between 6.8 to 7.5. The K,,, and Vmax of the partially purified enzyme were found to be 0.024 mM potassium ferricyanide and 673 umol ferricyanide reduced per min per mg enzyme respectively. Furthermore, the effect of cofactor concentration on the enzyme activity was studied and K,,, and Vmax values were found to be 0.02 mM NADH and 699 umol potassium ferricyanide reduced per minute per mg enzyme respectively.
Benzer Tezler
- Purification and characterization of two fractions of cytochrome b5 from sheep lung
İki sitokrom b5 franksiyonunun koyun akciğerinden saflaştırılması ve karekterizasyonu
NİLAY BAŞARAN
Doktora
İngilizce
1994
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Purification and spectral and catalytic characterization of nadh-cytochrome b5 reductase from lung microsomes
Başlık çevirisi yok
TÜLİN GÜRAY
- Partial purification and characterization of NADH-cytochrame b5 reductase from mullet liver microsomes
NADH-sitokrom b5 redüktaz enziminin kefal karaciğer mikroorganizmalarından kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu
ZAHİDE KABAKLAR
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ
- Isolation and characterization of two forms of soluble NADH cytochrome b5 reductase from human erythrocytes
Başlık çevirisi yok
ADİLE ŞAPLAKOĞLU(UMAY)
- Purification and characterization of cytochrome P4501A1 and cytochrome P450 reductase from feral leaping mullet (Liza salines) liver microsoms
Sitokrom P4501A1 ve P450 redüktazın doğal kefal balığı karaciğerinden saflaştırılması ve karakterizasyonu
ALAATTİN ŞEN
Doktora
İngilizce
1997
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMEL ARINÇ