A brighter method to illuminate the dark side of adhesion g protein-coupled receptors: detection of the ADGRG1 dimers by bioluminescence resonance energy transfer (BRET)
Adezyon g proteinine kenetli reseptörlerin karanlik tarafini aydinlatacak parlak metot: biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) ile ADGRG1 dimerlerinin gösterilmesi
- Tez No: 688593
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON, DR. ORKUN CEVHEROĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 128
Özet
G proteine kenetli reseptörler (GPKR), canlı hücrelerde oligomerik yapılar oluşturur ve bu kompleks yapılar reseptörün matürasyonu, trafiği ve sinyalizasyon mekanizmalarını etkiler. GPKR'lerin en büyük ikinci alt-ailesi olan adezyon G proteine kenetli reseptörler de (aGPKR), hücreler arası matriks ve komşu hücre yüzeyinde bulunan ligandlarla doku ve organ gelişimine etki etmek için etkileşime girerler. Fakat, aGPKR'lerin birbirleri ile etkileşime girip girmediği hala belirsizdir. Bu çalışmada, aGPKR'lerin dimerizasyonun canlı hücrelerde Biyolüminesan Rezonans Enerji Transferi (BRET) ile araştırılması için model bir aGPKR olan ADGRG1 kullanılmıştır. BRET donörü (NLuc) ya da akseptörü (EGFP) ile C-terminalindeki çeşitli pozisyonlardan işaretlenmiş ADGRG1 reseptörlerinin HEK 293 hücrelerinde ifade edilmesi sağlanmıştır. İşaretli reseptörlerin hücre içi lokalizasyonları lazer taramalı konfokal mikroskop ile doğrulanmıştır. C-terminalinden işaretli konstraktların hücre içi ifadeleri Western blotlama yöntemi ile belirlenmiş ve konstraktların işlevselliği biyolüminesans temelli Serum Response Element (SRE) Assay ile belirlenmiştir. EGFP ile işaretli bütün ADGRG1 konstraktlarının, WT ve N-terminalinden kesilmiş reseptörlerde olduğu gibi fonksiyonel oldukları gösterilmiştir. NanoLuc (NLuc) ve Renilla luciferase (RLuc)'in ikisi de coelenterazine'i okside ettikleri için, NLuc işaretli ADGRG1 reseptörleri SRE yöntemi ile test edilememiş ancak işaretlemeler aynı bölgeden yapıldığı için daha küçük bir tag olan NLuc ile işaretli reseptörler de fonksiyonel olarak sayılmıştır. ADGRG1 reseptörünün in vivo dimerizasyonunun saptanması için NLuc ile işaretli ADGRG1 konstraktları, EGFP ile işaretli ADGRG1 konstraktları ile birlikte transfekte edilmişlerdir. Etkileşime giren reseptörlerden dolayı meydana gelen BRET ölçülmüştür. C-terminalinden işaretli reseptörler ile karşılaştırıldığında, C-terminalindeki 667'inci amino asiti ardından işaretlenmiş ADGRG1 reseptörlerinde BRET artmıştır. Bu çalışmada belirtilen sonuçlar, aGPKR'lerden biri olan ADGRG1'ın homodimerizasyonuna hatta oligomerizasyonuna ilişkin ilk kez bilgi sağlamaktadır.
Özet (Çeviri)
G protein-coupled receptors (GPCRs) form oligomeric complexes in living cells, and these complex structures affect the receptor maturation, trafficking, and signaling processes. Adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs), the second-largest sub-family of GPCRs, interact with extracellular matrix and ligands on the adjacent cell surface to modulate tissue and organ development. However, it is still unclear whether aGPCRs interact with each other. In this study, ADGRG1 was used as a model aGPCR to investigate the aGPCR dimerization in living cells using Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET). BRET donor (NLuc) or acceptor (EGFP) tagged ADGRG1 receptors at various positions at C-terminus were expressed in HEK 293 cells. The cellular localizations of tagged receptors verified by laser scanning confocal imaging. The expression of C-terminally tagged constructs were determined using Western blot technique and their function was assessed with a bioluminesence based Serum Response Element (SRE) assay. The EGFP-tagged ADGRG1 constructs were all functional with elevated SRE activity as in the case for WT, and N-terminally truncated receptors. Since both NanoLuc (NLuc) and Renilla luciferase (RLuc) oxidize coelenterazine, NLuc-tagged ADGRG1 receptors could not be tested for the function using this method. However, as the tagging position was same and the tag NLuc was smaller in size these constructs were assumed to be functional. Various constructs of ADGRG1 tagged with NLuc were co-transfected with ADGRG1 EGFP constructs to determine the in vivo dimerization of ADGRG1. BRET resulting from the interacting receptor dimers was measured. Observed BRET increased in constructs tagged after 667th amino acid at C-terminus compared to the constructs with NLuc and EGFP appended at the end of C-terminus. The results given herein, suggest for the first time the homodimerization and may be oligomerization of ADGRG1, an aGPCR.
Benzer Tezler
- The relationship between gender and the key aspects of online consumer behavior
Cinsiyet ile onlıne tüketici davranışının temel yönleri arasındaki ilişki
ALİ N A YOUNES
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
İşletmeİstanbul Gedik Üniversitesiİşletme Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. METİN TOPTAŞ
- Şirketlerde birleşme ve devir işlemleri
Başlık çevirisi yok
YUSUF CEMİL SATOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
1994
İşletmeMarmara ÜniversitesiBankacılık ve Sigortacılık Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUSTAFA İME
- Makarnalık buğday çeşidinde ultrason teknolojisinin tavlama işlemi üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of ultrasound technology on the tempering process of durum wheat variety
BAHAR KAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Gıda MühendisliğiBalıkesir ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ YAVUZ YÜKSEL
- Negatif iyon yayan antimikrobiyal kompozit duvar boyasının geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of negative ion-emitting antimicrobial composite wall paint
AYÇA ASLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET BURÇİN PİŞKİN
- Okuma ve yazma eğitiminde yaratıcı drama
Creative drama in teaching reading and writing
ŞEYDA ÖZCAN
Doktora
Türkçe
2019
Eğitim ve ÖğretimGazi ÜniversitesiTürkçe ve Sosyal Bilimler Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GIYASETTİN AYTAŞ