Developing Fluorescent Sensors for the Bioimaging of Chelatable Iron(III) Ions
Şelatlanabilir Demir(III) İyonlarının Biyogörüntülenmesi için Floresan Sensörlerin Geliştirmesi
- Tez No: 710241
- Danışmanlar: PROF. DR. MAOLIN GUO
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: University of Massachusetts Amherst
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Anorganik Kimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 229
Özet
Demir vücut için önemli bir elementtir ve birçok metabolik süreçte önemli rol oynar. Geçici kararsız demir havuzunun (LIP) hücresel demir kaçakçılığı ve metabolizmasında kilit rol oynadığı öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu havuzdaki serbest demir iyonları (Fe3 + ve Fe2 +) toksiktir ve oksijen radikallerinin üretimine dahil olmaları nedeniyle hücrelere zarar verir. Hasarlar yaşlanmaya ve inme, kanser ve Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve ateroskleroz gibi çeşitli nörolojik bozukluklar gibi çeşitli hastalıklara yol açabilir. Hücrelerdeki serbest demir iyonlarının belirlenmesi, fizyolojik ve patolojik koşullar altında demirin işlevinin ve taşıma yollarının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir. Önceden kullanılan yöntemlerde bu karasız demir havuzunu belirleyebilmek hücrelerin parçalanması gerekmektedir. Son yirmi yılda, canlı hücrelerdeki metal iyonlarını herhangi bir hasar görmeden görselleştirmek için floresan sensörler ortaya çıkmıştır. Hücreler arası demir iyonlarını görselleştirmek için spesifik floresan sensörlere ihtiyaç vardır. Floresan sensörler yirmi yıldır hücrelere uygulanmış olsa da, yalnızca birkaç Fe3 + seçici sensör sınırlı başarı ile hücresel görüntüleme yeteneğine sahiptir. Bölüm 1, demirin biyolojik arka planını ve demir tespiti için yakın zamanda geliştirilen floresan sensörleri tanıtır. 2. bölümde, yeni bir rodamin bazlı sensör olan RPE sentezlenmiş ve 1H NMR, 13C NMR ve MS ile karakterize edilmiştir. Sensör, koordinasyon kaynaklı floresan aktivasyon (CIFA) mekanizması aracılığıyla ve diğer biyolojik ilgili metaller arsından belirgin bir hızlı ve geri dönüşümlü floresan tepkisi ile Fe3+'e yanıt vermiş. RPE, canlı insan SH-SY5Y hücrelerinde hücre altı çözünürlükte konfokal bir mikroskopla endojen şelatlanabilir Fe3+ ü gerçek zamanlı olarak kolayca tespit edebilir, iki kararsız Fe3 + havuzu mitokondride ve endozomlarda / lizozomlarda olduğu ilk kez başarılı bir şekilde bulunmuştur. Bu nedenle RPE, Fe3+ 'nın hücre biyolojisini araştırmak için umut verici bir araçtır. Görünür aralıkta ışık yayan RPE gibi sensörler, biyolojik dokulara uygulandığında otofloresans, yüksek ışık saçılması ve zayıf ışık penetrasyonunun neden olduğu içsel sinyal de dahil olmak üzere bazı önemli dezavantajlardan muzdariptir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, yakın kızılötesi sensörler kullanılabilir, çünkü daha uzun dalga boyunda yayılırlar, böylece düşük otofloresans arka planı gösterirler, dokulara daha derin nüfuz ederler ve biyolojik numunelere daha az zarar verirler. Bölüm 3'te heptasiyanin bazlı bir sensör olan IRPE sentezlenmiş ve 1H NMR, 13C NMR ve MS ile karakterize edilen IRPE, Fe3+ 'ya ACN / HEPES (1/1 v / v) çözeltisinde seçici tepki göstermiştir. Fe3+/IRPE'nin 1: 1 stokiyometride bağladığı bulunmuş ve bağlanma sabiti 2.0 × 105 M−1 olarak hesaplanmıştır. IRPE iyi bir Fe3+ seçici sensördür, ancak hücre çalışmaları hücrelerde serbest demir iyonlarını tespit edemediğini göstermiştir. Hücre geçirgen ve Fe3+ seçici yakın kızılötesi sensörler elde etmek için yakın kızılötesi sensör tasarımı stratejisinin değiştirilmesine karar verilmiştir. Bölüm 4'te, Changsha tabanlı bir sensör olan NIRh-Ac geliştirilmiştir. Sensör, diğer biyolojik olarak ilgili metal iyonlarından çok az etkileşerek, hücre içi Fe3 + seviyelerinin değişmesi üzerine belirgin bir hızlı ve geri dönüşümlü floresan tepkisi vermiştir. Konfokal deneyler, NIRh-Ac'nin canlı insan SH-SY5Y hücrelerinde ve canlı fibroblast hücresini (ws1) eksojen şelatlanabilir Fe3+'yı ve hücre altı çözünürlükte tayin edebildiğini göstermiştir. Fe3+ iyonları SH-SY5 hücrelerinin mitokondri ve endozomlarda/lizozomlarda bulunurken ws1 hücrelerin sadece mitokondrinde olduğu gözlenmiştir. Sensörle yapılan kinetik deneyler, insan fibroblast hücrelerinde Fe3+ taşıma yolunun gerçek zamanlı olarak, yani endozomlardan lizozomlara ve son olarak da sitozolü atlayarak doğrudan bir“Lizo-mito yerleştirme”mekanizması yoluyla mitokondriye görsel olarak görüntülenmesini sağlamıştır. Zebra balığı kullanan çalışmalar, canlı hayvanlarda Fe3+ görüntülemede NIRh-Ac sensörünün yeteneğini açıkça göstermiştir. Bölüm 5'te, hücrelerdeki endojen Fe3+ iyonlarını tespit etmek için başka bir Changsha tabanlı yakın kızılötesi sensör olan NRPA geliştirilmiştir. Fe3+ için son derece hassas, son derece seçici ve geri dönüşümlü bir yakın kızılötesi floresan sensördür. Sensör, diğer biyolojik olarak ilgili metal iyonlarından çok az etkileşerek, hücre içi Fe3+ seviyelerinin değişmesi üzerine belirgin bir hızlı ve geri dönüşümlü floresan tepkisi vermiştir. Konfokal deneyler, NRPA canlı insan SH-SY5Y hücrelerinde ve canlı fibroblast hücresini (ws1) endojen şelatlanabilir Fe3+'ü hücre altı çözünürlükte tayin edebildiğini göstermiştir. Fe3+'yı ve hücre altı çözünürlükte tayin edebildiğini göstermiştir. Fe3+ iyonları SH-SY5 hücrelerinin mitokondri ve endozomlarda/lizozomlarda bulunurken ws1 hücrelerin sadece mitokondrinde olduğu gözlenmiştir. Farklı hücre hatlarının demiri farklı şekillerde depoladığı / işlediği sonucuna varılmıştır. NRPA'nın zebra balıklarında endojen serbest Fe3 + iyonlarını saptama kabiliyeti de gösterilmiş ve 6 günlük zebra balıklarının karaciğer/safra kesesinde serbest Fe3+ iyonları bulunmuştur. Bölüm 6'da, son derece hassas, yüksek düzeyde seçici ve tersinir yakın kızılötesi Changsha tabanlı Fe3+ floresan sensörleri, NRPK ve NRP açıklanmıştır. İlk hedef Fe(II)-seçici floresan sensörünü sentezlemekti; ancak, NRPK'nın Fe(III) için bir sensör olduğu ortaya çıkmıştır. Hem NRP hem de NRPK, Fe3+'yı O/N/N bağlama motifiyle 2:1 oranında koordine eder. NRPK, koordinasyon için piridin halkasına bağlı karbonil grubunu kullanmıyor gibi görünüyor. NRPK ile hücre görüntüleme deneyleri, canlı sığır aort endotel hücrelerinde (BAEC) ve insan SH-SY5Y hücrelerinde endojen serbest Fe3+'yı, her iki hücre (SH-SY5Y ve BAEC) için mitokondri ve endozomlar/lizozomlarda bulunan serbest demir (III) iyonları ile hücre altı çözünürlükte kolayca tespit edebildiğini göstermiştir. Son olarak, NRPK, in vivo olarak zebra balıklarında değiştirilebilir serbest demir(III) tespit etme yeteneğini göstermiştir. Son olarak, LIP'deki Fe3+ konsantrasyonunu ölçmek ve RPE, NIRh-Ac, NRPA ve NRPK gibi sensörler tarafından gözlemlenen görüntülerin hücresel şelatlanabilir Fe3+'nın gerçek konumlarını yansıttığını doğrulamak için yeni bir sensör geliştirilmiştir. 7. bölümde bir ratiometrik yakın kızılötesi sensör olan CR-PK, sunulmuştur. CR-PK'nin Fe3+ ile reaksiyonu, CR-PK'nın spirosiklik kısmının halka açılmasına yol açar ve absorpsiyon bandında ~222 nm'lik büyük bir kırmızı kaymaya neden olur. CR-PK ile hücre görüntüleme deneyleri, CR-PK'nin çekirdek bölgesi dışında hücrelerde eşit olarak dağıldığını ortaya çıkarmış; bununla birlikte, şelatlanabilir kararsız Fe3+ iyonları, canlı sığır aort endotel hücreleri (BAEC), fibroblast (ws1) hücreleri ve insan nöroblastom hücresindeki (SH-SY5Y) belirli organellerde olduğu bulunmuştur. Ratiometrik sensör CR-PK, hücrelerde ilk kez endojen kararsız Fe3+ konsantrasyonunun doğrudan belirlenmesini sağmış ve ws1 için ~0,6 μM (Yöntem 1 ile 0,43 ± 0,23 μM ve Yöntem 2 ile 0,8 ± 0,28 μM) BAEC hücreleri için ~1,78 μM (Yöntem 1 ile 2,18 ± 0,35 μM ve Metot 2 ile 1,38 ± 0,47 μM) ve SH-SY5Y hücreleri için ~3,05 μM (Yöntem 1 ile 3,2 ± 0,63 μM ve Metot 2 ile 3,1 ± 0,53 μM) olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada geliştirilen çeşitli yüksek düzeyde seçici Fe3+ sensörleri, canlı hücrelerde ve canlı hayvanlarda Fe3+'nın moleküler görüntülenmesi için yeni araçlar sunar. Mikro ve nanomolar seviyelerde afinite ile Fe3+'e görünür ve yakın kızılötesi bölgelerde dalga boyunu kapsayan sensörler, çeşitli hücre hatlarında ve canlı hayvanlarda ilk kez tanımlanan şelatlanabilir Fe3+ havuzları ile gerçek zamanlı olarak hücre altı çözünürlükte Fe3+'yı görüntülemek için idealdir. Ayrıca ratiometrik sensör, ilk kez canlı hücrelerde Fe3+ konsantrasyonunun belirlenmesini sağlamıştır. Fe3+ sensörleri, demirin hücre biyolojisinin ve bununla ilgili patolojinin ve tıbbi uygulamaların daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.
Özet (Çeviri)
Iron is an essential element for the body and plays important roles in many metabolic processes. A transient labile iron pool (LIP) has been proposed to play key roles in cellular iron trafficking and metabolism. However, free iron ions (Fe3+ and Fe2+) in this pool are toxic and damaging to cells due to their involvement in the production of oxygen radicals. The damages may lead to aging and various diseases including stroke, cancer, and several neurological disorders like Parkinson's disease, Alzheimer's disease and atherosclerosis. Determination of free iron ions in cells may contribute to a better understanding of iron's function and transport pathways under physiological and pathological conditions. Early methods to identify a labile and transient iron pool needed to disrupt cells. Over the past two decades, fluorescent sensors have emerged to visualize metal ions in living cells without any damage. To visualize intercellular iron ions, specific fluorescent sensors are needed. Even though fluorescent sensors have been applied into cells for two decades, only a few Fe3+-selective sensors are capable of cellular imaging with limited success. Chapter 1 introduces the biological background of iron as well as recently developed fluorescent sensors for iron detection. In chapter 2, a new rhodamine-based sensor, RPE, was synthesized and characterized by 1H NMR, 13C NMR, and MS. The sensor responds to Fe3+ via coordination induced fluorescent activation (CIFA) mechanism and gives a distinct rapid and reversible fluorescence response upon the alteration of intracellular Fe3+ levels with little interference from other biologically relevant metal ions. RPE can readily detect endogenous chelatable Fe3+ via a confocal microscope in live human SH-SY5Y cells at subcellular resolution in real time, with two labile Fe3+ pools being successfully located in mitochondria and endosomes/lysosomes in both untreated and Fe3+-loaded human SH-SY5Y cells for the first time. RPE is thus a promising tool for probing the cell biology of Fe3+. Sensors, such as RPE, which emit lights in visible range, suffer from some significant drawbacks, including intrinsic signal caused by auto-fluorescence, high light scattering, and poor light penetration when they are applied to biological tissues. To overcome these limitations, near infrared sensors can be used because they emit at longer wavelength so they display low autofluorescence background, deeper penetration to tissues and cause less damage to biological samples. In chapter 3, a heptacyanine based sensor, IRPE, was synthesized and characterized by 1H NMR, 13C NMR, and MS. IRPE showed selective response to Fe3+ and binds it in a 1:1 stoichiometry with an apparent binding constant 2.0×105 M−1 in ACN/HEPES (1/1 v/v) solution. The sensor displays a change in color and fluorescence upon the alteration of Fe3+ levels in solution with a reversible response and little interference with other biological relevant metal ions. IRPE is a good Fe3+-selective sensor but, cell studies showed that it was not capable of detecting free iron ions in cells. To get cell permeable and Fe3+-selective near infrared sensors, it was decided to change the strategy for near-infrared sensor design. In chapter 4, a Changsha based sensor, NIRh-Ac, was developed. The sensor gives a distinct rapid and reversible fluorescence response upon the alteration of intracellular Fe3+ levels with little interference from other biologically relevant metal ions. Confocal experiments showed that NIRh-Ac could readily detect exogenous chelatable Fe3+ in live human SH-SY5Y cells and live fibroblast cell (ws1) at subcellular resolution, with the chelatable Fe3+ pools located in mitochondria and endosomes/lysosomes for SH-SY5 cells and in mitochondria for ws1 cells. Kinetic experiments with the sensor provided a visual imaging of Fe3+ transport pathway in human fibroblast cells in real time, i.e., from endosomes to lysosomes and finally to mitochondria via a direct“Lyso-mito docking”mechanism, bypassing the cytosol. Studies using zebrafish clearly demonstrated the capability of the NIRh-Ac sensor in imaging Fe3+ in live animals. In chapter 5, another Changsha-based near infrared sensor, NRPA, was developed to detect endogenous Fe3+ ions in cells. It is a highly sensitive, highly selective, and reversible turn-on near infrared fluorescent sensor for Fe3+. The sensor gives a rapid and reversible fluorescence response upon the alteration of intracellular Fe3+ levels with little interference from other biologically relevant metal ions. Confocal imaging studies demonstrate that NRPA can readily detect endogenous free Fe3+ in live human SH-SY5Y cells and live fibroblast cell (ws1) at subcellular resolution, with the chelatable Fe3+ pools located in mitochondria and endosomes/lysosomes in SH-SY5 cells while in mitochondria only in ws1 cells. It was concluded that different cell lines store/handle iron in different ways. The ability of NRPA to detect endogenous free Fe3+ ions in zebrafish was also demonstrated and free Fe3+ ions were found located in liver/gall bladder of 6-days-old zebrafish. In chapter 6, highly sensitive, highly selective, and reversible turn-on near infrared Changsha-based fluorescent Fe3+-sensors, NRPK and NRP were described. The initial goal was to synthesize Fe(II)-selective fluorescence sensor; however, NRPK turned out to be a sensor for Fe(III). Both NRP and NRPK coordinate Fe3+ with O/N/N binding motif with 2:1 ratio. The NRPK appears not to use the carbonyl group linked to the pyridine ring for coordination. Cell imaging experiments with NRPK showed that it could readily detect endogenous free Fe3+ in live bovine aortic endothelial cells (BAEC) and human SH-SY5Y cells at subcellular resolution, with free iron (III) ions located in mitochondria and endosomes/lysosomes for both BAEC and SH-SY5 cells. Finally, NRPK demonstrated the ability to detect exchangeable free iron(III) in zebrafish in vivo. Finally, a novel sensor was developed to quantify the concentration of Fe3+ in the LIP and to confirm that the images observed by the sensors such as RPE, NIRh-Ac, NRPA and NRPK reflect the true locations of cellular chelatable Fe3+, not instead the locations of the sensors themselves. A ratiometric near infrared sensor, CR-PK, was presented in chapter 7.The CR-PK sensor shows NIR and visible emission in its spirolactam ring-open and closed forms, respectively. The reaction of CR-PK with Fe3+ leads to the ring opening of the spirocyclic moiety of CR-PK, causing a large red shift ~222 nm of the absorption band. Cell imaging experiments with CR-PK revealed that CR-PK is evenly distributed in the cells except the nuclei region; however, chelatable labile Fe3+ ions are located in certain organelles in live bovine aortic endothelial cells (BAEC), fibroblast (ws1) cells and human neuroblastoma cell (SH-SY5Y). The ratiometric sensor CR-PK enables the direct determination of endogenous labile Fe3+ concentration in the cells for the first time, with a value of~0.6 μM determined (0.43 ± 0.23 μM by Method 1 and 0.8 ± 0.28 μM by Method 2 ) for ws1 cells, ~1.78 μM determined (2.18 ± 0.35 μM by Method 1 and 1.38 ± 0.47 μM by Method 2 ) for BAEC cells, and ~3.05 μM determined (3.2 ± 0.63 μM by Method 1 and 3.1 ± 0.53 μM by Method 2 ) for SH-SY5Y cells. The various highly selective Fe3+ sensors developed in this work offer novel tools for molecular imaging of Fe3+ in live cells and live animals. The sensors, covering wavelength in the visible and near infrared regions with affinity to Fe3+ in micro to nanomolar levels, are ideal to image Fe3+ at subcellular resolution in real time, with the chelatable Fe3+ pools identified in various cell lines and live animals for the first time. Moreover, the ratiometric sensor enabled the determination of Fe3+ concentration in live cells for the first time. The Fe3+ sensors will contribute to a better understanding of the cell biology of iron and its related pathology and medical applications.
Benzer Tezler
- Developing rhodamine-based fluorescent sensors for cellular iron (III) imaging
Hücresel demir (III) görüntüleme için rodamin bazlı floresan sensörlerin geliştirilmesi
ZİYA AYDIN
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
KimyaUniversity of Massachusetts DarmouthKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MAOLIN GUO
- Hedef kimyasala duyarlı floresan malzemelerin sentezi ve kimyasal sensörlerde kullanımı
Synthesis of fluorescent materials sensitive to target chemicals and usage in chemical sensors
FEHMİ KARAGÖZ
- Studies on utilization of new fluorescent compounds in chiral discrimination
Yeni floresan bileşiklerin kiral tanımada kullanılması üzerine çalışmalar
DUYGU TAN
Doktora
İngilizce
2020
KimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AKIN AKDAĞ
PROF. DR. ÖZDEMİR DOĞAN
- Development of Microwave/Droplet-Microfluidics Integrated Heating and Sensing Platforms for Biomedical and Pharmaceutical Lab-on-a-Chip Applications
Development of Microwave/Droplet-Microfluidics Integrated Heating and Sensing Platforms for Biomedical and Pharmaceutical Lab-on-a-Chip Applications
GÜRKAN YEŞİLÖZ
Doktora
İngilizce
2017
BiyomühendislikUniversity of WaterlooMühendislik Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CAROLYN L. REN
- Immobilization studies utilizing solid supports for the determination of fructose by dansylaminophenylboronic acid(dapb acid) and chromate by diphenylcarbazide(dpc)
Dansilaminofenilboronik asit ile fruktoz tayini ve difenilkarbazid ile kromat tayini için katı destek maddelere tutuklama çalışmaları
MUKADDER BULUT
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
KimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiAnalitik Kimya Ana Bilim Dalı
PROF.DR. MÜRVET VOLKAN
