Geri Dön

Analysis of total ada activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of DADA2 patients

DADA2 hastalarının periferik kan mononükleer hücrelerinde total ada aktivitesinin analizi

PDF İndir

  1. Tez No: 717348
  2. Yazar: TURNA DEMİRCİ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Adenozin deaminaz, Periferik sinirler, Adenosine deaminase, Peripheral nerves
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Adenozin Deaminaz Tip 2 Eksikliği, ADA2 geninde meydana gelen biallelik mutasyonların neden olduğu otozomal resesif bir hastalıktır. İlk olarak 2014 yılında, iki farklı grubun birbirinden bağımsız olarak yapmış olduğu çalışmalar sonucunda monogenik vaskülit sendromu olarak tanımlanmıştır. ADA2 Eksikliği'nin prevalansının 100.000'de 4 olabileceği gösterilmesine rağmen akrabalık derecesi ve kurucu varyantların varlığına bağlı olarak, hastalığın yaygınlığı etnik gruplar arasında farklılıklar gösterebilmektedir. Adenozin, çeşitli fizyolojik süreçlerin düzenlenmesinden sorumlu temel bir sinyal molekülüdür. Adenozin, fizyolojik koşullarda kanda ve dokularda düşük düzeyde yoğunlaşır, ancak inflamasyon sırasında yüksek miktarda ATP salınımı nedeniyle konsantrasyonu hızla artar. Dengeyi korumak için, adenozin hücrenin içinden dışına taşınabilir. Hücre dışı adenosin, G proteinine bağlı reseptörlerin bir sınıfı olan adenosin reseptörlerini bağlayabilir ve aktive edebilir. Reseptör aktivasyonu, hücre içi siklik AMP seviyesindeki değişiklikler yoluyla çoklu hücre içi süreçleri indükler. Ayrıca adenozin, adenozin konsantrasyonuna ve adenosin reseptörlerinin ekspresyonuna bağlı olarak proinflamatuar veya anti-inflamatuar fonksiyonda da işlev görebilir. Adenosine deaminaz, adenozini inozine ve 2'-deoksiadenozini 2'-deoksiinozine dönüştürerek adenozin homeostazının ve pürin metabolizmasının düzenlenmesinde görev alan bir enzimdir. İnsanda iki tane adenozin deaminaz izoformu bulunur. Bunlar ADA1 ve ADA2'dir. ADA1, 41 kDa'lık bir monomer proteindir ve asıl görevi, hücre içi adenosini katalize etmektir. ADA1, tüm hücrelerde eksprese edilmesine ek olarak, T ve B lenfositlerinde en yüksek ekspresyona sahiptir. ADA2 proteini ise 57-kDa ve homodimer bir yapıdadır ve 22. kromozomun uzun kolu(22q11.1) üzerinde yer alan ve 10 ekzondan oluşan Adenosine Deaminaz 2 (ADA2) geni tarafından üretilir. ADA2 proteinin N-terminal kısmında sinyal peptidleri olarak işlen gören hidrofobik kalıntılar vardır. Ayrıca N-terminal kısmı büyüme faktörü aktivitesinden sorumludur. Proteinin C-terminal kısmında ise korunmuş ADA katalitik alanı bulunmaktadır ve durum C-terminal kısmın adenozin deaminaz aktivitesinden sorumlu olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ADA2 proteininin N-terminal kısmı, α sarmal alanı olarak tespit edilmiştir. Katalitik alana eklenen 50 amino asidin, kemokinlerle çeşitli yapısal özellikleri paylaşan varsayılan bir reseptör bağlama (PRB) alanına katlandığı görülmüştür. PRB alanı, alfa ve beta katına sahiptir. Üç iplikli bir antiparalel beta tabakasından oluşur. İki iplikten oluşan ilmek, korunmuş bir disülfid bağı ile üçüncü ipe bağlanır. Ek olarak, oligosakkarit zincirleri, ADA2 molekülünün üç farklı bölgesinde bulunur. Bunlardan ikisi PRB alanının yakınında bulunurken, üçüncüsü molekülün karşı tarafında bulunur. Oligosakarit zincirleri ayrıca ADA2'yi proteolizden korur. Sonuç olarak, sinyal peptidinin, disülfid bağının ve glikozilasyon bölgelerinin varlığı, ADA2'nin hücre dışı ortama salgılandığını gösterir. ADA2 proteini, katalitik alanın yanı sıra protein dimerizasyon alanına ve hücre yüzeyi bağlama alanına da sahiptir. Dimerizasyon alanı enzim aktivitesi için gerekliyken ADA2'nin hücre yüzeyine bağlanması, dimerlerin stabilizasyonunu sağlamaktadır. ADA2 proteinleri farklı hücre yüzeylerine glikozaminoglikan zincirleri, T hücrelerine ise adenozin reseptörleri aracılığıyla bağlanır. Bu sayede hem sitokin benzeri hem de otokrin tipi büyüme faktörü özelliği gösterir. ADA2 proteini makrofaj polarizasyonunda görev alamakla beraber, nötrofil aktivasyonu için de önemli bir düzenleyici fonksiyona sahiptir. Ayrıca hücre dışı adenozinin neden olduğu ve proinflamatuar sitokinlerin aktivasyonuna yol açabilen, nötrofil ekstrasellüler tuzakların oluşumunu da önemli ölçüde azalttığı gözlemlenmiştir. ADA2 Eksikliği'nin klinik belirtileri çok çeşitli olmakla birlikte hastalığın en yaygın klinik görünümü vaskülittir. Genellikle ateşli ve sistemik inflamasyonu olan hastalarda epizodik klinik bulgular gözlenir. Deri ve nörolojik belirtilerle karakterize olmanın yanı sıra, daha az hastada renal ve gastrointestinal bulgular da vardır. Livedoid döküntü, hastaların %73'ünü etkileyen en yaygın kutanöz bulgudur. Ayrıca bazı hastalarda tek klinik bulgudur. Bunun dışında nodüler lezyonlar, Raynaud fenomeni, ülserler, dijital kangren gibi çeşitli cilt bulguları vardır. Hastaların %50-77'sinde nörolojik tutulum mevcuttur. En sık görülen nörolojik olay, genellikle laküner enfarktüs şeklinde olan ve 5 aylıkken bile ortaya çıkabilen iskemik inmelerdir. Akut veya kronik iskemi ile ilişkili başka nörolojik komplikasyonlar da mevcuttur. Bunlar nöbetler, baş ağrısı, ataksi, vertigo, entelektüel ve davranışsal problemler ve omurilik tutulumudur.Daha az yaygın olan hemorajik inmeler de belirtiler arasındadır. Santral sinir sistemi tutulumuna ek olarak, kraniyal sinir felci, nöropati ve mononöritis multipleks dahil olmak üzere hastaların %53'ünde periferik sinir sistemi tutulumu da görülebilir. Ayrıca, birkaç işitme kaybı ve oküler tutulum vakası da bildirilmiştir. Oküler tutulumlar şaşılık, konjonktivit, üveit, papillit ve optik nörit gibi değişkenlik gösterir. Mezenterde oluşan iskemi, iskemik karın ağrısına ve gastrointestinal perforasyona neden olabilir ve ölümcüllük de bildirilmiştir. Ayrıca hastalarda arteriyel anevrizmalar da gözlenmiştir. Diğer belirtiler karında renal arter anevrizması, segmental glomerüloskleroz ve renal amiloidozu içerir. Vaskülit ile ilişkili daha az yaygın semptomlar, testis ağrısı, pankreas enfarktüsü ve pankreatit dahil pankreas tutulumu, pulmoner kanama ve temporal arterittir. Kardiyomiyopati, koroner anevrizmalar ve karditler gibi kardiyak tutulumlar diğer nadir belirtilerdir. Vaskülit bulgularının dışında hastaların yarısından fazlası, enfeksiyöz olmayan ateş ataklarına sahiptir. Tekrarlayan oral ve genital ülserler, kas-iskelet sistemi semptomları, tekrarlayan karın ağrısı, inflamatuar bağırsak hastalığı ve immün yetmezlik de belirtiler arasındadır. Hematolojik bulgular arasındaysa yaygın olarak sitopeni, anemi ve nadiren görülen kemik iliği yetmezliği yer alır. Farklı fenotipler nedeniyle klinik bulgular tanı için yeterli değildir. DADA2 tanısı, patojenik varyantların saptanmasına ya da serum/plazmadaki ADA2 aktivitesinin ölçümüne bağlıdır. Patojenik varyantlar, Sanger dizilimi veya yeni nesil dizileme ile tespit edilebileceği gibi SNP dizileri, uzun menzilli polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), multipleks ligasyona bağlı prob amplifikasyonu gibi diğer moleküler testler de varyant analizi için kullanılabilir. DADA2 hastalarında azalmış veya saptanamayan ADA2 aktivitesi görülmüştür. Bu nedenle, HPLC veya ELISA ile plazma veya serum ADA2 aktivite testinin analizi de tanı için faydalıdır. Tedavi yöntemleri, semptomlara ve hastalığın ciddiyetine bağlı olarak seçilir. Günümüzde en yaygın tedavi yöntemi vaskülit fenotiplerinde yüksek başarı ile anti-TNF-α tedavisidir. En sık kullanılan anti-TNF ajanları etanercept, adalimumab, infliximab'dır. Anti-TNF tedavisinin yeni iskemik olaylara karşı koruyucu bir etki gösterdiği ve bireysel büyüme ve gelişme gibi diğer hastalık belirtilerinin de tedavi ile düzeldiği gözlemlenmiştir. TNF-α inhibitörleri özellikle vaskülit ve MSS bulgusu olan hastalarda uzun süreli tedavide kullanılabilir. Hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HSCT), ciddi hematolojik hastalıkların tedavisinde kullanılabilir. Diğer bir tedavi yöntemi ise taze donmuş plazma infüzyonlarıdır. Ancak, kısa yarılanma ömrü nedeniyle uzun süreli tedavi için uygun bir seçim değildir.Enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), çözünür maddeler içindeki proteini saptamak ve miktarını belirlemek için kullanılan bir yöntemdir. ELISA, antijen-antikor etkileşimine dayanır ve enzim aktivitesi kolorimetrik analiz ile ölçülür. Doğrudan, dolaylı ve sandviç ELISA gibi farklı ELISA türleri vardır. Doğrudan ELISA, ilk ve en basit tiptir ve kalitatif ve kantitatif antijen tespiti için uygundur. Yüzeye immobilize edilmiş bir antijen, enzim etiketli bir antikor ile inkübe edilir. Daha sonra eklenen substrat ve enzimin etkileşimi, bir spektrofotometre ile ölçülebilen renk değişikliği ile sonuçlanır. Dolaylı ELISA iki aşamalı bir süreçtir. İlk olarak, konjuge olmayan bir birincil antikor eklenir ve antijen ile inkübe edilir. Daha sonra etiketli ikincil antikor eklenir ve birincil antikora bağlanır. Daha sonra substrat eklenir ve ölçüm yapılır. Dolaylı ELISA, antikor taraması için uygundur. Sandviç ELISA en yaygın tiptir ve eşleştirilmiş antikor çiftleri olarak da adlandırılan iki spesifik antikor gerektirir. Yakalanan bir antikor yüzey üzerine kaplanır ve ilgili bir antijen eklenir, ardından inkübe edilir. Diğer antikor eklenir ve inkübe edilir. Uygun substrat eklendikten sonra ölçülür. Sandviç ELISA, ikinci antikorun etiketlenmesine göre iki tipe ayrılır: Doğrudan veya Dolaylı sandviç ELISA. Sandviç ELISA, çözünür veya düşük konsantrasyonlu antijenlerin saptanması için yararlıdır. Bu çalışmada DADA2 tanısı almış ve farklı mutasyonlara sahip hastaların periferik kan mononükler hücrelerindeki total adenozin deaminaz (ADA) aktivitesinin sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bunun için ADA2 eksikliği tanısı almış 8 hasta ve 5 sağlıklı birey ile çalışılmıştır. Hastalardan 2 tanesi Suriyelidir ve G47R/G321E heterozigot mutasyona sahipken, hastaların 3 tanesi G47R homozigot varyanta sahiptir. Total ADA aktivitesi, Abcam'in kolorimetrik ADA Activity Assay kiti kullanılarak, deneklerin periferik kan mononükler hücrelerinden hazırlanan lizatlarda ölçülmüştür. ADA aktivitesi kit protokolünde yazdığı şekilde hesaplanmıştır ve daha sonra t-test yöntemi ile sonuçların istatistiksel karşılaştırması yapılmıştır. Hastalığa neden olan ve dimerizasyon domainde meydana gelen p.G47R varyantı, ADA2 proteinin enzim aktivitesi için gerekli olan homodimerin stabilitesini etkiler. Bu yüzden p.G47R mutasyonu taşıyan hastalardaki, ADA2 katalitik aktivitenin azalmasına bağlı olarak total ADA aktivitesinin sağlık grubundan düşük olması beklenmektedir. İstatistiksel analizler sonucunda da ADA aktivitesinde önemli bir fark görülmüştür (p=0.0008). Beklenildiği gibi hasta grubunda sağlıklı gruba oranla daha düşük ADA aktivitesi gözlenmiştir. Ayrıca, heterozigot mutasyonu olan hastalar ile homozigot mutasyona sahip hastalar karşılaştırıldığında, ADA aktivitesinin heterozigot mutasyonu olan hastalarda daha düşük olduğu gözlenmiştir. Bu durumda p.G321E mutasyonunun katalitik aktivitede önemli rol oynadığı söylenebilir.

Özet (Çeviri)

Deficiency of Adenosine Deaminase Type 2 is an autosomal recessive disease caused by biallelic mutations in the ADA2 gene. It was first defined as monogenic vasculitis syndrome in 2014 as a result of studies conducted by two different groups independently. Although it has been shown that the prevalence of ADA2 Deficiency maybe 4 in 100,000, the prevalence of the disease may differ between ethnic groups, depending on the degree of consanguinity and the presence of founding variants. Adenosine deaminase is an enzyme involved in the regulation of adenosine homeostasis and purine metabolism by converting adenosine to inosine and 2'-deoxyadenosine to 2'-deoxyinosine. There are two isoforms of adenosine deaminase in humans, and one of them, the 57-kDa homodimer ADA2 protein, is produced by the Adenosine Deaminase 2 (ADA2) gene. The N-terminal portion of the ADA2 protein is responsible for growth factor activity, while the C-terminal portion is responsible for adenosine deaminase activity. In addition to the catalytic domain, the ADA2 protein also has a protein dimerization domain and a cell surface binding domain. ADA2 proteins bind to different cell surfaces via glycosaminoglycan chains and to T cells via adenosine receptors. In this way, it shows both cytokine-like and autocrine-type growth factor properties. Although the ADA2 protein is involved in macrophage polarization, it also has an important regulatory function for neutrophil activation. In addition, it significantly reduces the formation of neutrophil extracellular traps, which are caused by extracellular adenosine and can lead to the activation of proinflammatory cytokines. Despite the clinical manifestations of DADA2 being very diverse, episodic clinical findings are usually observed in patients with fever and systemic inflammation. The most common type is vasculitis findings. In addition to dermatological and neurological symptoms, it is also rarely defined by renal involvement and gastrointestinal system findings. More than half of patients have attacks of non-infectious fever. Symptoms include recurrent oral and genital ulcers, musculoskeletal symptoms, recurrent abdominal pain, inflammatory bowel disease, and immunodeficiency. Hematologic findings include cytopenia, anemia, and rare bone marrow failure. The diagnosis of the disease is made based on the detection of pathogenic variants on the ADA2 gene or the measurement of ADA2 activity in serum/plasma. Treatment methods are selected depending on the symptoms and the severity of the disease. Currently, anti-TNF-α is the most common treatment modality, especially for patients with signs of vasculitis. Hematopoietic stem cell transplantation can be used in the treatment of hematological diseases. In addition, although it is not a suitable choice for long-term treatments, fresh frozen plasma infusions are also among the treatments applied. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a method used to detect and quantify protein in soluble substances, based on antigen-antibody interaction and measuring enzyme activity by colorimetric analysis. The purpose of this study was to compare the total adenosine deaminase (ADA) activity in peripheral blood mononuclear cells of patients diagnosed with DADA2 with the control group. 8 patients diagnosed with ADA2 deficiency and 5 healthy individuals were studied. Two of the patients are Syrian and have a G47R/G321E heterozygous mutation. 3 of the patients have G47R homozygous. Total ADA activity was measured in lysates prepared from subjects' peripheral blood mononuclear cells using a colorimetric ADA Activity Assay kit that is a commercial kit. ADA activity was calculated by following the protocol written in the kit, and then the statistical comparison of the results was analyzed by performing the t-test. The disease-causing variant p.G47R, which occurs in the dimerization domain, affects the stability of the homodimer required for enzyme activity of the ADA2 protein. Therefore, due to the decrease in ADA2 catalytic activity in patients with p.G47R mutation, it is expected that the total ADA activity will be lower than in the healthy group. As a result of statistical analysis, a significant difference was observed in ADA activity (p=0.0008). As expected, ADA activity was lower in the patient group compared to the healthy group. In addition, when patients with heterozygous mutations were compared with patients with homozygous mutations, lower ADA activity was observed in patients with heterozygous mutations. In this case, it can be said that the G321E mutation plays an important role in catalytic activity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    612018

    Differential expression of proteins in active and inactive phases of Behçet's syndrome

    Behçet sendromunun aktif ve inaktif fazlarında farklı protein ekspresyonları

    KIYMET ASLI KİREÇTEPE AYDIN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI

  2. Tez No

    982082

    İntertrokanterik kalça kırığı öncesi ciddi derecede hareketsiz olan ileri yaş osteo sarkopenik hastalarda venöz tromboemboli riski az midir? Trombosit yüzey antijeni genetik analizi

    Is the risk of venous thromboembolism reduced in elderly osteosarcopenic patients with intertrochanteric hip fracture and severe pre-fracture immobilization? A genetic analysis of platelet surface antigens

    BERK GEDİK

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    GenetikSağlık Bilimleri Üniversitesi

    Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSMAİL DEMİRKALE

  3. Tez No

    192942

    Ailevi Akdeniz Ateşi?ne bağlı inflamatuar ataklarda ASC,CASP1 ve IL-1B genlerinin ekspresyonlarının incelenmesi.

    Analysis the expression of ASC, CASP1 and IL-1B in Familial Mediterranean Fever patients

    ARİS ÇAKİRİS

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. AHMET GÜL

  4. Tez No

    389407

    The effect of HLA DPB1 alleles on the immune response in chronic Hepatitis B

    Kronik Hepatit B hastalığında HLA DPB1 allelerin hastalığın immun yanıta etkisi

    NİLAY GURBET KARATAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DOÇ. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  5. Tez No

    282088

    Genel cerrahi hastalarında LMA-Fastrach içinden entübasyon veya laringoskopi ile endotrakeal entübasyonun hemodinamik yanıt üzerine etkilerinin karşılaştırılması.

    The comparison of the effects of endotracheal intubation with LMA-Fastrach or endotracheal intubation with laryngoscopy on hemodynamic response in general surgery patients.

    MUSTAFA ÖZGÜR CIRIK

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    Anestezi ve ReanimasyonSağlık Bakanlığı

    Anesteziyoloji ve Reanimasyon Ana Bilim Dalı

    DR. HAYAL TEZEL KARTAL

Geri Dön