Geri Dön

Development of novel BCL-2 inhibitors for glial tumors by using in vitro and in vivo systems

In vitro ve in vivo sistemler kullanılarak glial tümörler için yeni BCL-2 inhibitörlerinin geliştirilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 736339
  2. Yazar: ŞEYMA ÇALIŞ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI, DR. ÖĞR. ÜYESİ TİMUÇİN AVŞAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 133

Özet

Glioblastoma Multiforme (GBM), dünya çapındaki beyin tümörü vakalarının çoğunu oluşturan glial tümörlerin en ölümcül versiyonudur. GBM'yi etkili bir şekilde tedavi etmek için farklı yaklaşımlar olmuştur ve son yıllarda moleküler patoloji, hedefe yönelik terapi ve kişiselleştirilmiş tıp alanlarında gerçekleştirilen ilerlemelerle beraber GBM tedavisi ile ilişkili olabilecek birçok yolak çalışılmıştır. GBM'ler için bu tür bir tedavi adayı Bcl-2 yolağıdır. Bcl-2 yolayığının antiapoptotik üyeleri GBM hücre ölümünün düzenlenmesinde önemli bir role sahiptir. Bu tez çalışmasında, yedi potansiyel Bcl-2 inhibitör molekülü test edilmiştir ve bunların GBM hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkileri ve Bcl-2'yi inhibe etme kapasiteleri belirlenmiştir. Bu yedi bileşikten üçünün, yani 58, 243 ve ind-199'un A172 GBM hücre hattına olan etkileri analiz edilmiştir. 58 ve ind-199'un, GBM hücreleri üzerinde herhangi bir önemli çoğalma önleyici etki göstermediği görülmüştür. In vitro proliferasyon deneylerine göre en umut verici olan, tiazolidin türevi BH3 mimetiği olan 243 molekülünün etki mekanizmasının araştırılmasına karar verilmiştir. A172 GBM hücreleri ile yapılan proliferasyon testine ek olarak YKG1 GBM hücrelerinin proliferasyonunu değerlendirmek için koloni oluşturma testi gerçekleştirilmiştir. 243, kontrol grubuna kıyasla hücre büyümesini önemli ölçüde inhibe ederken, Bcl-2 inhibitörü ABT-199'un hücre proliferasyonunu inhibe etmediği görülmüştür. Ayrıca, kanser kök hücreleri (KKH) üzerindeki etkinliğini belirlemek için YKG1 tümör küreleri üzerinde 243 test edilmiştir. Hem ABT-199 hem de 243'ün, KKH proliferasyonu üzerinde inhibitör etkiye sahip olduğu, ancak 243'ün kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ABT-199'dan önemli ölçüde daha etkili olduğu gözlemlenmiştir. 243 bir Bcl-2 inhibitörü olduğundan, Bcl-2 yolağının bazı önemli elemanları ve intrinsik apoptoz yolağı analiz edilmiştir. BCL2, BCLXL, BAX, CASP3, CASP7 ve CASP9'un gen ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Ayrıca, hücre ölümü ile ilgili diğer bazı genler olan CASP8 ve TP53 de analiz edilmiştir. Zamana bağlı kantitatif RT-PCR sonuçları, Bcl-2 inhibitörleri ABT-263 ve 243 ile tedavi edilen GBM hücrelerinin, apoptoz ile ilgili gen ekspresyonları durumunda farklı davrandığını göstermiştir. Daha sonra, Annexin V-PI boyaması ile apoptotik hücre ölümü tayin edilmiştir. İlginç bir şekilde, ABT-199 veya 243 ile tedavi edildiklerinde A172 hücrelerinde herhangi bir apoptoz tespit edilmemiştir. Benzer şekilde, hücre döngüsü analizi, ABT-199'un hücreleri G1 fazında durdurduğunu, fakat 243'ün hücre döngüsü üzerinde herhangi bir etkisi olmadığını göstermiştir. Ayrıca, apoptoz ile ilişkili proteinler PARP, Caspase-3 ve Caspase-9'un ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Apoptozu indüklemek için pozitif kontrol olarak staurosporine kullanılmıştır. Staurosporine dışındaki tedavi gruplarının hiçbiri kesilmiş-PARP ekspresyonunu artırmamıştır. Benzer şekilde, Pro- caspase-3 ve Pro-caspase-9 ekspresyonunda bir fark olup olmadığı kontrol edilmiştir ve sadece staurosporine ile tedavi edilen grubun daha düşük pro-caspase seviyeleri ifade ettiği gözlemlenmiştir. Dolayısıyla, hem Caspase-3 hem de Caspase-9'un aktif formlarının sadece staurosporine uygulanması üzerine üretildiği gösterilmiştir. Literatürde glial hücrelerde BCL2 ifadesinin düşük olduğu bilinmektedir. Bu sebeple, hem ABT-199 hem de 243'ün sadece sınırlı apoptotik hücre ölümünü indükleyebildiğini varsayarak A172 hücre hattının BCL2 ekspresyonu belirlenmiştir. Beklendiği gibi, elimizdeki hücre dizileri arasında BCL2 gen ekspresyon seviyelerini karşılaştırdığımızda, A172 hücrelerinde BCL2 ekspresyonunun çok düşük olduğu, SH- SY5Y nöroblastom hücrelerinde ise çok daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle, ABT-199 ve 243 ile yapılan bir tedaviden sonra SH-SY5Y hücrelerinin apoptoz seviyelerini analiz etmeye karar verilmiştir. Her iki inhibitörle yapılan tedavinin sadece 48 saat içinde, SH-SY5Y hücrelerinin apoptotik hücre ölümünü tetiklediği görülmüştür. Bu sonuçlar üzerine, A172 hücrelerinin hangi mekanizma ile öldüğünü açıklayabilmek üzere yeni bir hipotez oluşturulmuştur. Bcl-2, otofaji ile ilişkili bir protein olan Beclin 1 ile bir kompleks oluşturduğundan, hücrelerin otofaji yoluyla ölebileceği düşünülmüştür. BH3 bağlanma bölgesi bulunan Beclin 1'in, 243 uygulanması sonucu Bcl-2 ile bağlantısının kopabileceği öngörülmüştür. 243 tedavisinin, BECN1, ATG5 ve MAP1LC3B gibi otofajiyle ilişkili genlerin ifadelerini önemli ölçüde arttırdığı, ABT-199'un ise sınırlı bir düzeyde otofajiyi indüklediği gösterilmiştir. Ayrıca, otofajinin önemli belirteçlerinden biri olan LC3B-II protein ekspresyonu, 243 tedavisi sonrasında önemli ölçüde artmıştır. DMSO ve ABT-199 uygulanan gruplarda ise LC3B-II ekspresyon artışı görülmemiştir. Ek olarak, apoptoz, hücre döngüsü ve otofaji arasındaki etkileşimde rolü olan p53'ün protein ekspresyon seviyesi belirlenmiştir. Literatürde p53 ekspresyonunun artışının otofajiyi desteklediği gösterilmiştir. Buna göre, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hem ABT-199 hem de 243 tedavisinde p53 protein ekspresyonunun arttığı gözlemlenmiştir. Beklendiği gibi, Beclin 1:Bcl-2 etkileşimini ve 243'ün BH3 bağlanma bölgesine bağlanmasını hesaplamalı olarak analiz ettiğimizde, 243'ün Beclin 1 BH3 domain ve ABT-199'un Bcl-2'ye bağlandığı önemli etkileşimlere benzer etkileşimler yoluyla gözlemlenmiştir. Dahası, 243'ün Bcl-2 aktif bölgesi ile yaptığı etkileşimlerin bazılarının çok daha güçlü olduğu görüldü. Bir diğer analiz ise 243'ün Bcl-2 aktif bölgesine bağlanmak için ihtiyaç duyduğu enerjinin, Beclin 1 BH3 domain ve ABT- 199'dan daha düşük olduğunu göstermiştir. Bu sonuçların ışığında, 243 ve Beclin 1 aynı domainden Bcl-2'ye bağlandığından, hücreler 243 ile tedavi edildiğinde, Beclin 1 Bcl-2'ye bağlanamaz ve bu nedenle otofajiyi başlatmak için serbest kalmış olur. Ek olarak, 243'ün ortotropik beyin tümörü modellerinde in vivo tümör büyümesini önemli ölçüde azalttığı, kontrol ve ayrıca ABT-263 ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla hayatta kalma süresini uzattığı gösterilmiştir. Ayrıca, 243'ün primer glial hücre hatları üzerindeki anti-proliferatif etkileri de değerlendirilmiştir. 243, evre 2 oligodendroglioma olan OLG3 hücre hattı haricindeki, farklı evre ve histopatolojiye sahip tüm hücre hatları üzerinde anti-proliferatif etki göstermiştir. OLG3, OLG7 ve GBM9 hücre hatlarının kantitatif RT-PCR sonuçlarına göre, OLG3'ün daha düşük bir BCL2 ekspresyon seviyesine sahip olduğunu gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar, yüksek BCL2 ekspresyonu olan hastaların 243 tedavisinden fayda görebileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, bu tez çalışmasında 243'ün Beclin 1:Bcl-2 kompleksini bozduğu, dolayısıyla otofajik hücre ölümünü aktive ettiği gösterilmiştir. Bu sebeple 243 tedavisinin GBM tedavisi için potansiyel bir terapötik olarak klinikte BCL2 ifadesi yüksek hastalar için fayda sağlayabileceği öngörülmektedir.

Özet (Çeviri)

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most malign form of glial tumors, which accounts for the majority of brain tumor cases worldwide. There have been different approaches to treat GBM effectively, and with the advancements made for the last decade molecular pathology, target driven therapy, and personalized medicine gained attraction. One of such promising targets for GBM is Bcl-2 induced intrinsic apoptosis pathway. Anti-apoptotic members of Bcl-2 induced intrinsic apoptosis pathway have an important role in the regulation of GBM cell death. In this thesis study, we screened seven potential Bcl-2 inhibitor compounds and evaluated their effects on proliferation of GBM cells as well as their inhibitory capacity of Bcl-2 protein. Of those, I further analyzed three of them namely 58, 243, and ind-199. 58 and ind-199 compounds did not show any significant anti-proliferation effect on GBM cells. Eventually, we decided to elucidate the mechanism of action of 243 compound, a thiazolidine derivative BH3 mimetic, which was the most promising one according to the in vitro proliferation experiments. I performed colony formation assay to assess proliferation of YKG1 GBM cells, additionally to the proliferation assay with A172 GBM cells. While 243 inihibited cell growth significantly compared to control group, Bcl-2 inhibitor ABT-199 did not inhibit cell proliferation. Moreover, I tested 243 on YKG1 tumorspheres to determine its effectivity on tumor initiating cancer stem cells (CSC). Both ABT-199 and 243 had inhibitory effect on CSC proliferation, however 243 was significantly more effective than ABT-199 when compared to control group. Since 243 is a Bcl-2 inhibitor, I analyzed key players of Bcl-2 family and intrinsic apoptosis pathway. I have analyzed gene expression levels of BCL2, BCLXL, BAX, CASP3, CASP7, and CASP9. Furthermore, I also analyzed genes related with cell death which are CASP8 and TP53. Time dependent quantitative RT-PCR results suggested that, GBM cells that are treated with Bcl-2 inhibitors ABT-263 and 243 acts differently in case of gene expressions related to apoptosis. Next, we wanted to show apoptotic cell death with Annexin V-PI assay. Interestingly, we did not detect significantly elevated apoptosis in A172 cells when they are treated with either ABT-199 or 243. Similarly, cell cycle analysis showed that 243 did not have any effect on cell cycle, altough ABT-199 induced G1 phase arrest. Moreover, I determined expression levels of apoptosis related proteins PARP, Caspase-3, and Caspase-9. I used staurosporine treatment as a positive control to induce apoptosis. None of the treatment groups apart from staurosporine increased cleaved-PARP expression. Similarly, I checked if there is a difference in expression of Pro-caspase-3 and Pro-caspase-9, and observed that only stauroporine treated group expressed lower levels of Pro-caspases, indicating that cleaved forms of both Caspase-3 and 9 were produced upon staurosporine treatment only. At this point, we hypothesized that both ABT-199 and 243 could only induce limited apoptotic cell death because BCL2 expression was relatively low in A172 cell line. Expectedly, when I compared gene expression levels among different cell lines, I observed that BCL2 expression was very low in A172 cells, and it was abundant in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Therefore, I decided to analyze apoptosis of SH-SY5Y cells after a treatment with ABT-199 and 243. Within only 48 hours of treatment with both inhibitors, I observed apoptotic cell death of SH-SY5Y cells. Hence, we had a new hypothesis that when BCL2 expression is low, upon Bcl-2 inhibitor treatment, cells may die through autophagy since Bcl-2 forms a complex with autophagy related protein Beclin 1. I showed that 243 treatment significantly upregulated autophagy related genes such as BECN1, ATG5, and MAP1LC3B, whereas ABT-199 induced autophagy on limited level. Moreover, autophagy indicative LC3B-II expression was significantly upregulated on a protein level with the 243 treatment, when compared to control as well as ABT-199 treatment. Additionally, I determined protein expression level of p53, which has a role in the interplay between apoptosis, cell cycle, and autophagy. I observed that p53 protein expression was increased upon both ABT-199 and 243 treatment, when compared to control group. Expectedly, when we performed in silico computational analysis, Beclin 1:Bcl-2 interaction and binding of 243 to their BH3 binding domains, we observed that 243 binds to Bcl-2 through important interactions. Since 243 and Beclin 1 binds to Bcl-2 from the same domain, when cells are treated with 243, Beclin 1 cannot bind to Bcl-2 and therefore it is released to initiate autophagy. In addition, we demonstrated that 243 significantly reduced in vivo tumor growth and prolonged survival in orthotropic brain tumor models, compared to vehicle group as well as ABT-263 treated animals. Furthermore, I assessed the anti-proliferative effects of 243 on primary glial cell lines as well. 243 exerted anti-proliferative effect on all patient derived glioma cell lines that have different grades and histopathology, except OLG3 cell line which is a grade 2 oligodendroglioma. According to quantitative RT- PCR results of OLG3, OLG7, and GBM9 cell lines I observed that OLG3 has a lower expression level of BCL2. These results suggest that patients with high BCL2 expression might benefit from 243 treatment. Taken together, our results indicate that 243 disrupts Beclin 1:Bcl-2 complex, hence activates autophagic cell death, and may serve as a potential therapeutic for the treatment of GBM.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    480555

    A novel approach to targeted therapy for prostate cancer: Combination of BCL-2 and akt inhibitors

    Prostat kanseri için hedefleme tedavisinde yeni bir yaklaşım olarak: BCL-2 ve akt inhibitörlerinin kombinasyonu

    EZGİ AVŞAR APDİK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SABİRE FERDA KALEAĞASIOĞLU

  2. Tez No

    752917

    Targeting bag-1S/C-raf interaction for therapeutic intervention in cancer

    Bag-1S/C-raf etkileşiminin kanserde terapötik bir yaklaşım olarak kullanılmak üzere hedeflenmesi

    ÖZGE TATLI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  3. Tez No

    713827

    The role of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein l-like (hnrnpll) in t cell homeostasis

    Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein l-like (hnrnpll)'ın t hücre homeostazındaki rolü

    MEHMET YABAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Allerji ve İmmünolojiThe Australian National University

    İmmünoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GERARD F. HOYNE

  4. Tez No

    310021

    Bevasizumab sıçan endometriyozis modelinde apoptozisi indükler

    Bevacizumab induces apoptosis in the rat endometriosis model

    DİDEM SOYSAL

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Kadın Hastalıkları ve DoğumDokuz Eylül Üniversitesi

    Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CEMAL POSACI

    PROF. DR. ÖMER ERBİL DOĞAN

  5. Tez No

    353647

    mTOR sinyal yolağının rapamycin ile baskılanması durumunda CDK inhibitörlerinin terapotik etkilerinin LNCaP, DU145 ve PC3 prostat kanseri hücrelerinde incelenmesi

    Başlık çevirisi yok

    ÖZGE BERRAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Biyolojiİstanbul Kültür Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ELİF DAMLA ARISAN

Geri Dön