Targeting bag-1S/C-raf interaction for therapeutic intervention in cancer
Bag-1S/C-raf etkileşiminin kanserde terapötik bir yaklaşım olarak kullanılmak üzere hedeflenmesi
- Tez No: 752917
- Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 107
Özet
Kanser tanı ve tedavisindeki ilerlemelere rağmen, kadınlarda meme kanseri birincil ölüm sebebidir. Tedaviden sonuç alınamamasının en önde geleni nedeni, yüksek doz terapötik ajanların neden olduğu, hastalığın tekrarlamasıyla sonuçlanan kazanılmış ilaç direncidir. Kazanılmış ilaç direnci, kanser tedavisinin etkinliğini engelleyen veya azaltan en temel sorunlardan biridir. İlaç direncinin oluşumuna katılan temel mekanizmalar; metabolik değişiklikler, ilaç hedeflerinin mutasyonu ve amplifikasyonu gibi kanser tedavisi sırasında ve/veya kanser tedavisinin bir sonucu olarak ortaya çıkan hücresel yeniden düzenlemeleri kapsar. Bu direnç yollarının ortaya çıkışı, üstesinden gelinmesi daha zor bir klinik tabloya neden olmaktadır. İlaç direncinin küresel yükü, daha etkili özel terapiler sunmayı ve kansere karşı yeni terapötik hedefler aramayı gerektirmektedir. Kanser gibi komples hastalıklara karşı yeni terapötik hedefler bulmaya yönelik bu acil ihtiyaç protein-protein etkileşimlerinin (PPE'ler) potansiyelini araştırma konusunda hızla artan bir ilgiye neden olmuştur. Bugün, farmasötik topluluk, PPE'leri bloke eden küçük moleküller ve monoklonal antikorlar için ayırdığı kaynakları önemli ölçüde arttırmıştır. Monoklonal antikor PPE inhibitörlerinin farmasötik satışlardaki hakimiyeti, PPE inhibitörlerinin başarısının bir kanıtıdır. Hücredeki bilgi akışı, PPE'lerde sinyalleri iletmek için araç görevi gören proteinler aracılığıyla sağlanır. Kanserde, PPE'ler, entegre bir biyolojik çıktı elde etmek için moleküler ağlar boyunca patofizyolojik sinyallerin iletimi için uğrak yerleri olarak görev alır ve böylece hücre büyümesi gibi hücresel süreçlerde bozulmalara yol açar. Bu nedenle, temel PPE'leri inhibe ederek neoplastik sinyal yolaklarını bozmak, onkojenik sinyallerin iletimini engellemek kanser tedavisinde umut verici bir yaklaşımdır. Bu tür etkileşimleri bloke eden PPE hedefli terapötiklerin geliştirilmesi için, hastalıkla ilişkili proteinlerin etkileşim yüzeyleri içinde yer alan amino asitlerin ve hedef protein yüzeylerinde“ilaçlanabilir”bölgelerin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. Ko-şaperon Bcl-2 ile ilişkili athanojen 1 (Bag-1) proteini, insan dokularında düşük seviyelerde ifade edilirken, çeşitli kanser türlerinde sıklıkla aşırı ifade edilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarla, Bag-1 proteininin onkogenik rolü giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bag-1'in C-Raf ve B-Raf serin/treonin protein kinazlar ile etkileşime girdiği gösterilmiştir. Bu kinazlar, sinyal ağlarının kurulması için kritik olan ve hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını düzenleyen RAS/Raf/MEK/ERK yolağında yer alan majör bileşenlerdir. Kanser hücrelerinin RAS/Raf/MEK/ERK sinyalleme kaskadının aktivasyonundan yararlandığı göz önüne alındığında, karsinogenezde yer alan bu kaskadı hedefleyen yenilikçi tedaviler geliştirmek büyük önem taşımaktadır. Bag-1, C-Raf ve B-Raf arasındaki etkileşim, kanser hücrelerinin uzun süre hayatta kalmasını hedeflemede kritik bir rol belirler. Bag-1 (Bcl-2 ile ilişkili atanojen), C-Raf ile doğrudan etkileşime girerek Raf ile ilişkili onkojenik dönüşüme katkıda bulunur. Bag-1/C-Raf etkileşimini modüle eden küçük moleküller ve/veya peptitler, kanser ilerlemesini hedefleyebilecek bir terapötik yaklaşım olma potansiyeli taşımaktadır. Ancak, bu etkileşim halindeki proteinler arasındaki bağlayıcı arayüz henüz tanımlanmamıştır. Bu kompleksin etkileşim yüzeyinin tanımlanması, gelecekte klinik kullanım için yeni ilaçların geliştirilmesine katkı sağlayacaktır. Bu bağlamda, bu çalışmanın amacı, hem moleküler hem de yapısal tekniklerin kullanılmasıyla gerçekleştirilen Bag-1 ve C-Raf'ın oluşturduğu kompleksin etkileşim yüzeyinin haritasını çıkarmaktır. Bunun için, Bag-1'in küçük izoformunun üç boyutlu yapısı ve domen organizasyonu ilk olarak Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) ile tanımlanmış ve Bag-1S'nin küçük molekül bağlanmasına uyum sağlayabilen“ilaçlanabilir”bölgeleri araştırılmıştır. Bu amaçla, Bag-1S ilk olarak, moleküler klonlama yoluyla N-ucuna eklenen hekzahistidin etiketi aracılığıyla Ni-NTA afinite saflaştırması kullanılarak hücre lizatından saflaştırılmış ve ardından polihistidin etiketi, TEV proteaz ile kesilerek uzaklaştırılmıştır. Ardından gerçekleştirilen ikinci bir Ni-NTA saflaştırması yoluyla, Bag-1S proteini His-etiketli TEV enziminden ve komşu histidinleri içeren safsızlıklardan uzaklaştırılmıştır. Saflaştırılmış Bag-1S, jel elektroforezinde 33-kDa'lık bir görünür bant göstermiştir. Proteinin saflığı, SDS-PAGE jelinin ImageJ ile analiz edilmesiyle %95 olarak belirlenmiştir. Bag-1S izoformunun döteryum alım seviyesini takip etmek için, 12 saniye ila 24 saat arasında değişen beş zaman noktası kullanılarak HDX-MS deneyleri gerçekleştirilmiş ve yaklaşık %99 sekans kapsamı ile Bag-1S'ye ait ~150 peptit tanımlanmıştır. HDX-MS verileri kullanılarak, peptit-spesifik döteryum alım oranları, Bag-1S'nin tüm dizi homoloji modeli üzerine yansıtılmış ve genel yapı üzerinde döteryum alımı değerlendirilmiştir. BAG domeni, UBL (ubikuitin benzeri) alanına kıyasla daha solventten korunmuş ve stabilize bir yapı sergilemiştir. Dönüş bölgeleri daha kararsız iken, sarmal koşulların mevcut olduğu bölgeler, izlenen tüm süre boyunca değişmeden kaldı. Adaptör bir protein olan Bag-1'in çoklu etkileşim ortakları, özellikle BAG alanı ile etkileşime girer. İlginç bir şekilde, bu ortakların etkileşim bölgeleri solventten en çok korunan bölgelerle çakışmaktadır. Bag-1S'nin hidrojen döteryum değişim profili, tam uzunluktaki Bag-1S yapısı üzerinde proteinin elektrostatik potansiyeli ve hidrofobikliği ile karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. Yüklü ve hidrofilik bölgelerle çevrelenen BAG alanındaki solvent korumalı bölgenin potansiyel bir etkileşim bölgesine sahip olduğu düşünülmektedir. BAG alanındaki bu solvent korumalı bölge, bir ilaç hedefi olabilecek bir bağlanma bölgesi olabileceği gösterilmiştir. HDX-MS deneylerinin ardından, Bag-1S/C-Raf kompleksinin stokiyometrisini belirlemek amacıyla çapraz bağlama (cross-linking) deneyleri gerçekleştirilmiştir. 3xFlag etiketli-C-Raf Flag HEK293T hücrelerine transfekte edildikten sonra Flag saflaştırma metodu kullanılarak memeli hücre lizatından saflaştırılmıştır. Saflaştırılan proteinler, ikili kompleks oluşturmak üzere bir araya getirilmiş, ardından çapraz bağlama ajanı olan DSS (disuksinimidil suberat) ile konjugasyon yoluyla kovalent olarak bağlanmıştır. İmmünoblotlama sonrası elde edilen sonuca göre Bag-1S ve C-Raf 2:2 sitokiyometri ile etkileşmiş, bu da Bag-1S'nin C-Raf'ın dimerizasyonu tetikleyerek C-Raf aktivasyonuna katkıda bulunuyor olabileceğini göstermiştir. Bag-1S/C-Raf kompleksinin arayüzünü seçici olarak belirlemek için membran üzerinde in vitro bağlanma deneyleri gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan C-Raf, PVDF membranı üzerinde immobilizasyonunun ardından saflaştırılmış Bag-1S ile in vitro ortamda inkübe edilmiştir. Bag-1S'ye bağlı peptitler düşük pH ile elüe edilmiş ve oluşan kompleks membran üzerinde sınırlı triptik kesime tabi tutulduktan sonra LC-MS/MS ile analiz edilmiştir. LC-MS/MS'ten elde edilen verilere göre, 20 amino asit uzunluğunda bir peptit tanımlanmış, bu bölgenin Bag-1S'nin C-Raf ile olan etkileşimine katıldığı gösterilmiştir. Ayrıca, C-Raf'ın kinaz alanının protein yapısını (PDB ID 5OMV) ve Bag-1'in modellenmiş tam uzunlukta protein yapısını kullanarak bir in silico yanaştırma çalışması gerçekleştirilmiştir. En düşük enerji puanına sahip pozların bazılarında, Bag-1S'nin K137, T140, Q144, K149 ve L156 amino asitlerinin Bag-1/C-Raf bağlanma bölgesine katılan amino asitler olduğu bulunmuştur. Bu bölge, HDX-MS'de ve in vitro bağlanma deneylerinde tanımlanan“ilaçlanabilir”etkileşim bölgesiyle korelasyon göstermektedir. Belirlenen bağlanma arayüzünü doğrulamak ve tanımlanan peptit dizisindeki mutasyonların Bag-1S/C-Raf bağlanmasını etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için bölgeye yönelik yönlendirilmiş mutajenez deneyleri gerçekleştirilmiştir. Mutant Bag-1S proteinleri ile gerçekleştirilen bağlanma deneylerine göre, K149A ve L156R mutasyonlarının, Bag-1S'nin HSP70 ile olan etkileşimini koruduğu, ancak C-Raf ile etkileşimini istatistiksel olarak anlamlı ölçüde bozduğu ve aynı zamanda bu mutasyonların, yabanıl tip Bag-1S'ye kıyasla MCF-7 hücrelerinin hayatta kalmasında önemli bir azalmaya yol açtığı bulunmuştur. Ek olarak, bu mutasyonlar Bag-1S'nin bilinen doğrudan etkileşim ortakları Bcl-2 ve HSP70 ile etkileşimini etkilemezken, Beclin 1, Akt dahil olmak üzere hücre sağkalımını düzenleyen diğer yollarda yer alan komplekslerle etkileşimini de zayıflatmaktadır. In vitro bağlanma deneyleri, Bag-1S'nin Beclin 1 ya da B-Raf ile ikili bir etkileşim kurmadığını göstermektedir. Bu nedenle Bag-1 proteininin doğrudan etkileşim partneri olmayan bu proteinlerle etkileşiminin C-Raf aracılığıyla olabileceği düşünülmüştür ki bu da Bag-1 proteininin Raf kinazlarla olan etkileşiminin moleküler olarak hedeflenmesi yaklaşımının kanserde hücre sağ kalımını inhibe etmeye yönelik potansiyelini güçlendirmektedir. Daha sonra, Bag-1S ile etkileşim kuran C-Raf bölgesi, membran üzerinde in vitro bağlanma deneyi sonrası gerçekleştirilen LC-MS/MS analiziyle tanımlanmıştır. Kompleksin tanımlanan etkileşim bölgelerine karşılık gelen nativ Bag-1 ve C-Raf dizilerinden türetilen dört farklı peptit tasarlanmış ve katı faz sentezi kullanılarak sentezlenmiştir. Ardından, sentezlenen peptitlerin Bag-1S/C-Raf kompleksinin oluşumunu engelleyip engellemediği in vitro olarak test edilmiştir. Bu peptitler arasından Bag-1S'nin C-Raf bağlayıcı bölgesini hedefleyen Pep 3, Bag-1S/C-Raf etkileşimini C-Raf ile yarışmalı olarak istatistiksel olarak anlamlı ölçüde engellemiştir. Pep 3, yalnızca C-Raf'ın Bag-1S ile ikili etkileşimini engellemekle kalmamış, aynı zamanda TAP çöktürme deneylerinde Bag-1S'nin BAG domeni üzerinden gerçekleşen diğer ilişkili komplekslerini de bozduğu gösterilmiştir. Pep 3 tarafından sağlanan çoklu Bag-1S etkileşimlerinin inhibisyonu, kanser hücrelerinin uzun süreli sağkalımını bozma potansiyelini desteklemektedir. Bu nedenle, bu çalışma ile C-Raf üzerindeki bu bölgenin Bag-1 bağlanmasından sorumlu olduğunun doğrulanmasının yanı sıra, aynı zamanda, kanser tedavisi için geliştirilme potansiyeline sahip Bag-1S'yi hedefleyen yeni bir peptit inhibitörü keşfedilmiştir.
Özet (Çeviri)
Breast cancer-dependent mortality that is the leading cause of female death, continues to rise despite the progression in diagnosis and therapeutic strategies in cancer. The primary reason for this deteriorating status is cancer drug resistance caused by higher doses of therapeutic agents, which might lead to failure in cancer treatment and recurrence of the disease. The global burden of drug resistance calls for offering more effective tailored therapies and seeking new therapeutic targets against cancer. A growing interest in probing the potential of protein-protein interactions (PPIs) is driven by the urgent need to find novel therapeutic targets against such diseases. Today, the pharmaceutical community has increased the resources behind small molecules and monoclonal antibodies that block PPIs. The dominance of monoclonal antibody PPI inhibitors in pharmaceutical sales is a record of the success of PPI inhibitors. Information flow in the cell is achieved through proteins acting as vehicles to convey signals in PPIs. In cancer, PPIs serve as hubs for the transduction of pathophysiological signals along molecular networks to achieve an integrated biological output, thereby leading to malfunctions in cellular processes such as cell growth. Thus, disrupting neoplastic signaling pathways by inhibiting key PPIs offers significant promise for inhibiting the transmission of oncogenic signals. For the development of PPI-targeted therapeutics that block such interactions, identifying the residues located within the interaction surfaces of disease-associated proteins is of great importance. The co-chaperone Bag-1 (Bcl-2-associated athanogene 1) is produced at low levels in human tissues, while it is usually upregulated in a variety of carcinoma cells. The role of Bag-1 as an oncogene is becoming increasingly evident. Bag-1 has been revealed to associate with C-Raf and B-Raf serine/threonine protein kinases. They are implicated in the RAS/Raf/MEK/ERK pathway, critical for establishing signaling networks and regulating cell proliferation and survival. Consequently, the interaction between Bag-1 and C-Raf is important for preventing the prolonged survival of tumor cells. Bag-1 (Bcl-2 associated athanogene) directly interacts with C-Raf to contribute to Raf-associated oncogenic transformation. Bag-1 (Bcl-2 associated athanogene) contributes to Raf-associated oncogenic transformation by directly interacting with C-Raf. Given that cancer cells benefit from RAS/Raf/MEK/ERK activation, it is crucial to develop innovative therapeutic strategies that target this cascade involved in carcinogenesis. Small molecules and/or peptides that modulate the interaction of Bag-1/C-Raf would potentially serve as a convenient treatment for cancer progression. However, the binding interface between these interacting partners has not been defined yet. Defining the interaction surface of this complex may aid in the development of novel drugs for clinical use in the future. In this context, this study aims to map the interaction surface of the complex formed by Bag-1 and C-Raf, which was accomplished through the use of both molecular and structural techniques. For this, the three dimensional structure and domain architecture of the small isoform of Bag-1 were first examined by Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS), and the regions on Bag-1S that can accommodate small molecule binding were probed to assess its“druggability”. To this end, Bag-1S was first purified from cell lysate using Ni-NTA affinity purification through the incorporated hexahistidine tag, and subsequently, the tag was cleaved with TEV protease. A subsequent Ni-NTA purification was carried out in a flow-through mode to collect Bag-1S separate from His-tagged TEV enzyme and impurities that contained neighboring histidines. The purified Bag-1S showed an apparent 33-kDa band in gel electrophoresis. Sample purity was estimated at over 90% using ImageJ analysis of SDS-PAGE gel. To monitor the deuteration level of the Bag-1S isoform, HDX-MS experiments with five time-points that ranged from 12 s to 24 h were carried out and revealed the identification of ~150 peptides of the Bag-1S with a sequence coverage of 98%. Using HDX-MS data, peptide-specific deuterium incorporation rates were projected onto the modeled structure of Bag-1S and deuterium uptake was analyzed on the Bag-1S full-length structure. BAG domain exhibited a more solvent-protected and stabilized structure compared to the UBL (ubiquitin-like) domain. While turn regions are more labile, the regions where the helical conditions exist remained unexchanged during the entire monitored time. Multiple interaction partners of the adapter protein Bag-1 engage specifically with the BAG domain. Interestingly, the interaction sites of these partners coincide with the regions that are most solvent-protected. The interaction site is supposed to be located in the solvent-protected region of the BAG domain, which is surrounded by charged and hydrophilic regions. This solvent-protected region in the BAG domain likely possesses an interaction region, revealing a potential“druggable”binding site. To further evaluate the binding stoichiometry of the Bag-1S with C-Raf, cross-linking assays were performed in the subsequent experiments. To accomplish this, C-Raf and Bag-1S proteins were affinity-purified, which was followed by the combination of purified proteins to form an in vitro complex. Covalent coupling of the formed complexes was then performed with a cross-linking agent, DSS (disuccinimidyl suberate). According to the results obtained after immunoblotting of cross-linked samples, Bag-1S and C-Raf formed a 2:2 stoichiometric complex, suggesting that Bag-1S might contribute to C-Raf activation by triggering its dimerization. After the Bag-1S/C-Raf interaction was affirmed and stoichiometrically tested, on-membrane in vitro binding experiments were conducted to selectively identify the interface of the complex. The purified C-Raf was immobilized on a PVDF membrane and incubated with purified Bag-1S in vitro. Bag-1S-bound peptides were recovered and analyzed by LC-MS/MS after the formed complex was subjected to limited tryptic digestion on the membrane. A 20-amino acid length peptide was identified as a plausible C-Raf interacting peptide in the BAG domain of Bag-1S. Further, an in silico docking study was also conducted using the protein structure of the kinase domain of C-Raf (PDB ID 5OMV) and the modeled full length protein structure of Bag-1. In some of the poses with the lowest docking energy score, K137, T140, Q144, K149, and L156 residues of Bag-1S were found to occupy the Bag-1/C-Raf binding site. This region coincides with the plausible“druggable”interaction site identified in HDX-MS and on-membrane in vitro binding experiments. Site-directed mutagenesis experiments were then carried out to confirm the identified binding interface and to evaluate if mutations in the determined peptide sequence affect the binding of Bag-1S/C-Raf or not. Upon mutagenesis, K149A and L156R substitutions significantly decreased the endogenous levels of p-C-Raf (S338) and p-MEK1/2 (217/221) in MCF-7 cells. Consistently, TAP-pull down experiments demonstrated that these substitutions impaired the interaction of Bag-1S with C-Raf, without affecting its HSP70 contact. They also led to a significant decrease in the survival of MCF-7 cells compared to wild-type Bag-1S. In addition, while these mutations did not affect the interaction of Bag-1S with its known direct interaction partners, Bcl-2 and HSP70, they resulted in the disruption of its interaction with the complexes involved in other regulatory cell survival pathways, including B-Raf, Beclin 1, and Akt. Subsequent in vitro binding experiments did not reveal a binary interaction of Bag-1S with either Beclin 1 or B-Raf, at least under our experimental conditions. Therefore, it has been hypothesized that the formation of a Bag-1/Beclin 1 or Bag-1/B-Raf complex might require the presence of C-Raf as a mediator. Further, Bag-1S interacting C-Raf region was identified by on-membrane in vitro binding experiment coupled with LC-MS/MS. Four different peptides derived from native Bag-1 and C-Raf sequences corresponding to the plausible interaction segments of the complex were designed and then synthesized by using solid-phase synthesis. The ability of the peptides to hamper the formation of a Bag-1S/C-Raf complex was tested in vitro. Of these peptides, Pep 3 that targets C-Raf binder region of Bag-1S significantly altered Bag-1S/C-Raf interaction. Pep 3 not only impeded the binary interaction of C-Raf with Bag-1S but also disrupted BAG-associated complexes of Bag-1 in TAP pull-down experiments. Inhibition of multiple Bag-1S interactions afforded by Pep 3 bolsters its potential to impair the prolonged survival of cancer cells. We therefore not only affirmed that this region on C-Raf is responsible for Bag-1 binding, but also discovered a novel peptide inhibitor targeting Bag-1S, which has the potential to be improved for cancer therapy.
Benzer Tezler
- Characterization of BAG-1S/C-raf interaction targeting peptide
BAG-1S/C-raf etkileşimini hedefleyen peptitin karakterizasyonu
ECENUR ÇEBİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Investigation of the effects of the bag-1 – hsc70/hsp70 interaction on the bag-1 complexes in erad mechanism and ubiquitin/proteasome system
Bag-1 – hsc70/hsp70 etkileşiminin erad yolağı ve ubikitin/proteazom sistemindeki bag-1 komplekslerine olan etkisinin incelenmesi
EZGİ BAŞTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Biyofizikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Türkiye'de 2010 sonrası izlenen para politikalarının döviz piyasalarına etkileri
Monetary policies impact to the exchance market in Turkey after 2010
İPEK BAĞ
- Fabrication of magnetic bioactive glass nanoparticles
Manyetik biyoaktif cam nanopartiküllerinin üretimi
CANSU TAŞAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Bilim ve TeknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BATUR ERCAN
- Kurala bağlı para politikası kapsamında parasal hedefleme: Türkiye örneği
Monetary targeting in the context of rule based monetary policy: The Turkish case
AYLİN ABUK DUYGULU
