Biochemical characterisation of truncated amylopullulanase from Thermoanaerobacter brockii brockii
Thermoanaerobacter brockii brockii kaynaklı amilopullulanaz enziminin kesilmiş varyantlarının biyokimyasal karakterizasyonu
- Tez No: 737086
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 143
Özet
Tüm zamanların en iyi kimyageri olan doğanın gerçekleştirdiği kimyasal dönüşüm sonucunda en son gelinen nokta yaşamdır. Yaşamı mümkün kılan kimyasal dönüşümden ise evrimsel süreçle meydana gelen biyolojik katalizörler olan enzimler sorumludur. İnsanlar enzimlerin gerçekleştirdiği reaksiyonlardan bu katalizörlerin varlığını bilmediği dönemlerden tarih boyunca birçok alanda çeşitli ürünlerin eldesi için yararlanmışlardır. Zamanla bu reaksiyonları gerçekleştiren biyomoleküllerin yani enzimlerin yapısı, çalışma prensibinin açığa çıkarılması ve karakterizasyonlarının yapılması ile bu biyokatalizörlerin ne kadar büyük bir potansiyele sahip olduğu anlaşılmış bununla birlikte ekstemofilik organizmaların ve bu organizmalara ait enzimlerin keşfi ayrıca yürütülen protein mühendisliği çalışmaları ile de zorlu endüstriyel koşullara dayanıklı enzimler elde edilerek enzimlerin her geçen gün kullanım alanı genişletilmiştir. Günümüzde 3.000'den fazla enzim biyoteknolojik ve endüstriyel alanda kullanılmakta ve 2021 yılında bu enzim pazarının büyüklüğü 6 milyar ABD dolarına ulaştığı raporlanmaktadır. % 30'luk payla bu pazarı domine eden enzimler ise yiyecek ve içecek endüstrisinde kullanılan enzimler olup bu grup içerisinde de üstünlüğü ele alanlar nişasta işleme uygulamalarında kullanılan enzimlerdir. Birçok tarım ürününün ana bileşeni olan ve çoğu insan için birincil karbonhidrat kaynağını oluşturan nişasta, dünyada bulunan en temel karbon kaynağıdır. Nişastanın yanı sıra hidrolizi sonucu elde edilen oligosakkarit, disakkarit ve monosakkaritler de gıda, farmasötik ve biyoyakıt gibi çok çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Hidroliz ürünlerinin eldesi için nişasta, jelatinleştirme, sıvılaştırma ve sakkarifikasyon olmak üzere üç basamaktan oluşan bir prosese tabi tutulur. Jelatinleştirme işlemi ile viskoz çözeltisi elde edilen nişastanın, sıvılaştırma ve sakkarifikasyon işlemleri sırasında da α-amilaz, β-amilaz, glikoamilaz ve pullulanaz enzimleri kullanılarak nişastanın yapısında bulunan α-1,4- ve α-1,6- glikozidik bağlarının hidrolizi sağlanıp istenilen hidroliz ürünün eldesi sağlanır. Tüm bu işlemler sırasında enzimlerin uzun süre stabil kalıp aktivitesini sürdürmesi için pH ayarlamaları ve aktivite gösterebilmeleri için Ca2+ iyonunun eklenmesi gerekmektedir. Yapılan pH ayarlamaları ve Ca2+ iyonunun eklenmesi yeni bir işlem basamağı oluşturmakta ve pH ayarlamaları, oluşan tuz çökeltileri ve fazla Ca2+ iyonlarının işlem sonucunda uzaklaştırılması için ek basamak eklenmesi gerekmektedir. Tüm bunlar ise üretim maliyetinin artmasına sebep olmaktadır. Hem bu basamakları elimine etmek hem de tek basamaklı sıvılaştırma-sakkarifikasyon işlemini gerçekleştirmek alernatif bir enzim ile mümkünolmaktadır. Amilopullulanazlar (E.C. 3.2.1.1/41) hem α-1,4- hem de α-1,6- glikozidik bağlarını hidrolize edebilen enzimler olup ekstremofilik organizmalardan elde edilenler ise yüksek sıcaklıklarda ve asidik pH'larda aktivitelerini sürdürebilmektedirler. Bu çalışma kapsamında nişasta hidroliz işlemlerinin güçlü adaylarından biri olan Thermoanaerobium brockii brockii organizmasına ait amilopullulanaz (TbbApu) enzimi incelenmektedir. Yapılan çalışmalar sonucunda, uygun ekspresyon vektörü olarak pET-28 a (+) vektörü, uygun konakçı olarak da E. coli BL21 (DE3) konakçısı seçilmiştir. Tüm bunların yanı sıra C-terminalinde bulunan SH3 ve CBM20 bölgelerinin (domain) ekspresyon üzerine olan etkisini incelemek için i) SH3 domaini çıkarılmış olan TbbApuΔSH3 ve ii) SH3 domaini ile birlikte CBM20 bölgesi çıkarılmış olan TbbApuΔCBM20 varyantları elde edilmiştir. Tamamlanan bu tez kapsamında ise TbbApuΔSH3 ve TbbApuΔCBM20'ye ek olarak SH3 ve CBM20 bölgeleri ile birlikte enzimin N-terminalinde yer alan iki adet X25 bölgelerinin deçıkarılması ile elde edilen dört varyantının- TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 ve TbbApuΔX25-2-CBM20- oluşturulması ve böylece literatürde henüz görevi tanımlanmamış olan X25 bölgelerinin enzimin substrat bağlanmasına, aktivitesine ve stabilitesine olan etkilerinin açığa çıkarılması hedeflenmiştir. Ayrıca TbbApu ve bugüne kadar elde edilen kesilmiş altı varyantının tümünün biyokimyasal karakterizasyonu, ham nişasta bağlama yeteneği ve kinetik çalışmaları tamamlanmıştır. Öncelikle 5' uçlarında sırasıyla SacI ve NotI restriksiyon enzimleri kesim noktası bulunan ileri ve geri primerler yardımıyla tüm apu geni kalıp olarak kullanılarak TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 ve TbbApuΔX25-2-CBM20'e ait genler PZR metodu ile çoğaltılmıştır. Çoğaltma sonucunda sırasıyla 4065, 3750, 3375 ve 3060 baz çifti uzunluğunda tbbApuΔX25-1-SH3, tbbApuΔX25-2-SH3, tbbApuΔX25-1-CBM20 ve tbbApuΔX25-2-CBM20 genleri elde edilmiştir. Elde edilen genler ve pET-28 a (+) ekspresyon vektörü SacI ve NotI enzimleri ile kesilerek yapışkan uçlar oluşturulmuş böylece genler pET-28 a (+) ekspresyon vektörüne yapıştırılmaya uygun hale getirilmiştir. Uçları kesilen her bir gen ile pET-28 a (+) ekspresyon vektörü için T4 DNA ligaz enzimi yardımıyla ligasyon reaksiyonu kurulmuş ve kurulan reaksiyonla oluşturulmuş vektörlerin kompetent E. coli BL21 (DE3) konakçı hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kolonilerden pozitif kolonilerin tayini için kolonilerin yarısı red pullulan içeren agar plakalara ekilmiştir. Ayrıca indükleme için 1 µM IPTG ve seleksiyon için 40 µg/mL kanamisin agara dahil edilmiştir. 16 saat inkübasyon sonrası hem hücrelerin patlaması hem de enzimlerin aktivite gösterebilmesi için 60 °C`de 4 saat boyunca konulan plakalardan tbbApuΔX25-1-SH3 - pET-28 a (+) vektörü içeren 5 koloni, tbbApuΔX25-2-SH3 - pET-28 a (+) vektörü içeren 2 koloni, tbbApuΔX25-1-CBM20- pET-28a (+) içeren 3 koloni ve tbbApuΔX25-2-CBM20- pET-28 a (+) vektörü içeren 3 koloni tespit edilmiştir. Tespit edilen pozitif kolonilerin kontrolü için kolonilerin diğer yarısı Luria-Bertani (LB) sıvı ortamına ekilmiş ve bu hücrelerden plazmit izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İzole edilen plazmitler FastDigest SacI enzimi ile kesilerek lineer hale getirilmiş ve plazmitlerin uzunluğu tespit edilmiştir. Yapılan linerizasyon ile 9434 baz çifti uzunluğunda tbbApuΔX25-1-SH3 - pET-28 a (+) vektörü; 9119 baz çifti uzunluğunda tbbApuΔX25-2-SH3 - pET-28 a (+) vektörü, 8744 baz çifti uzunluğunda tbbApuΔX25-1-CBM20- pET-28 a (+) vektörü ve 8429 baz çifti uzunluğunda tbbApuΔX25-2-CBM20- pET-28 a (+) vektörü seçilen tüm kolonilerden elde edilmiştir. Klonlama işleminden elimizde bulunan TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20, TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 ve TbbApuΔX25-2-CBM20 varyantlarının ekspresyonu magic media kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ekspresyonu gerçekleştirilen tbbApu enziminin 6 varyantı sırasıyla metal afinite kromatografisi, iyon değiştirme kromatografisi ve ısı ile pürifikasyon yöntemleri kullanılarak üç basamakta saflaştırılabilmiştir. Ardından TbbApu enzimi ve altı varyantının pullulanaz ve α-amilaz aktivitesinin kontrolü için red pullulan ve nişasta içeren poliakrilamit jel ile analizi yapılmıştır. Enzimlerin biyokimyasal karakterizasyonu kapsamında öncelikle sıcaklık, pH, metal iyonları, organik solvent, deterjan ve inhibitörlerin enzimlerin pullulanaz ve α-amilaz aktivitesine etkileri incelenmiş, ayrıca sıcaklık, pH ve organik solventlerin enzim stabilitesine olan etkileri tespit edilmiştir. Biyokimyasal karakterizasyon sonucunda pullulanaz aktiviteleri için optimum reaksiyon sıcaklık değerlerinin TbbApu, TbbApuΔSH3 ve TbbApuΔCBM20 için 70 °C, TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 için 75 °C, TbbApuΔX25-2-CBM20 için 80 °C derece, α-amilaz aktiviteleri için optimum reaksiyon sıcaklık değerleriTbbApu, TbbApuΔSH3 ve TbbApuΔCBM20 için 75 °C, TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 ve TbbApuΔX25-2-CBM20 için 80 °Colduğu gösterilmiştir. Sıcaklığın enzimlerin stabilitelerine olan etkisi incelendiğinde ise 24 saat inkübasyon sonrasında en stabil kaldıkları sıcaklık değerleri TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20, TbbApuΔX25-1-SH3 ve TbbApuΔX25-2-SH3 için 60 °C, TbbApuΔX25-1-CBM20 için50 °C ve TbbApuΔX25-2-CBM20 için 40 °C olarak tespit edilmiştir. Pullulanaz ve amilaz aktivitelerine göre optimum pH değerleri ise TbbApu, TbbApuΔX25-1-SH3 ve TbbApuΔX25-1-CBM20 için 6.5, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20 ve TbbApuΔX25-2-SH3 için 6, TbbApuΔX25-2-CBM20 için ise 7 olarak bulunmuş ve enzimlerin hem pullulanaz hem de amilaz aktivitelerinin % 80'ine pH 5 ile eriştiği ve pH 8'e kadar koruduğu tespit edilmiştir. Farklı pH değerlerinin enzimlerin stabilitelerine olan etkileri incelendiğinde ise 24 saat inkübasyon sonucu pullulanaz aktivitelerine göre TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20 ve TbbApuΔX25-2-CBM20'nin pH 4, TbbApuΔX25-2-SH3'ün pH 6, TbbApuΔX25-1-SH3 ve TbbApuΔX25-1-CBM20'nin pH 6.5'ta; α-amilaz aktivitelerine göre ise TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20'nin pH 3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 ve TbbApuΔX25-2-CBM20'nin pH 6, TbbApuΔX25-1-SH3'ün pH 7'de en stabil kaldığı gösterilmiştir. Ayrıca TbbApu ve varyantlarının geniş bir pH aralığı olan pH 3 ve 8'de stabilitelerini koruyabildikleri tespit edilmiştir ve asidik pH'larda stabil kalması ise TbbApu'nun nişasta hidroliz işlemlerinde pH ayarlamasına gerek görülmeksizin kullanılabileceğini böylece bu prosesin işlem basamakları ve dolayısıyla maliyet azaltmasını sağlayabileceği göstermektedir. Metal iyonların etkisi incelendiğinde ise Mn2+ ve Co2+ iyonlarının TbbApu ve varyantlarının hem pullulanaz hem de α-amilaz aktivitesini arttırdığı; Mg2+, Zn2+ ve Al3+ iyonlarının ise TbbApuΔCBM20 varyantının pullulanaz aktivitesi hariç bütün enzimlerin her iki aktivitesini de düşürdüğü tespit edilmiştir. Böylece Mn2+ ve Co2+ iyonlarının aktivatör Mg2+, Zn2+ ve Al3+ iyonlarının ise inhibitör etkiye sahip olduğu görülmüştür. Nişasta işleminde kullanılan α-amilaz enzimlerinin Ca2+ metaline bağımlı olduğu halde TbbApu ve varyantlarının aktivite ve stabilite için Ca2+ metaline bağımlı olmaması enzimi bu tür işlemler için kullanılmak üzere güçlü bir aday haline getirmektedir. Organik solventlerden ise % 20 ve % 50 hekzan ve aseton varlığında bazı istisnalar hariç TbbApu ve varyantlarının hem pullulanaz hem amilaz aktivitelerini de arttırdığı; % 20 ve % 50 konsantrasyonlarda butanol, DMF ve DMSO'nun ise enzimlerin her iki aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe ettiği tespit edilmiştir. Organik solventlerin enzimlerin stabilitesine olan etkileri incelendiğinde 24 saat inkübasyon sonucu bazı istisnalar hariç enzimlerin hem pullulanaz hem de α-amilaz aktivitelerine göre % 20 ve % 50 aseton ve hekzan varlığında stabilitelerinin arttığı görülmüştür. İnhibitörlerin ise TbbApu ve varyantlarının bazı istisnalar hariç enzimlerinin pullulanaz ve α-amilaz aktivitelerini orta derecede inhibe ettiği buna karşın bütün inhibitörlerin TbbApuΔCBM20'nin pullulanaz aktivitesini arttırdığı görülmüştür. Aynı şekilde kullanılan noniyonik ve aniyonik enzimlerin bazı istisnalar hariç her iki aktivitesini de orta derecede inhibe ettiği buna karşın katyonik deterjan olan CTAB'ın varlığında bütün enzimlerin aktivitelerinin güçlü bir şekilde inhibe olduğu görülmüştür. Daha sonra hem TbbApu hem de kesilmiş varyantlarının kinetik parametreleri belirlenmiştir. Yapılan çalışmlar sonucu TbbApu'dan X25 domainin çıkarılması enzimin hem pullulanaz hem de α-amilaz aktivitesini iyileştirmiştir. Bununla birlikte CBM20 ve X25 bölgelerinin çıkarılması enzimin çözünür nişastaya karşı hem afinitesi hem de spesifitesinin düşmesine sebep olmuş; enzimin pullulana karşı spesifitesini arttırmıştır. Bunların yanı sıra ham nişasta bağlama kapasiteleri ölçülen enzimlerde SH3 ve karbonhidrat bağlama modülü olan CBM20 bölgesinin çıkarılması herhangi bir etki yaratmazken; SH3 ile X25 bölgelerinin sırayla çıkarılması % 27.3 ve % 58.4, CBM20 ile X25 bölgelerrinin çıkarılması ise % 90 ham nişasta bağlanma yeteneğinde azalışa sebep olmuştur. Böylece X25 bölgesinin ham nişasta bağlamada görevli olduğu ortaya çıkarılmıştır. TLC analiz sonucu ise TbbApu ve varyantlarının pullulan hidrolizi ile maltotrioz, nişasta hidrolizi ile ise maltotrioz ve maltoz bileşenlerinin açığa çıktığını göstermektedir.
Özet (Çeviri)
The last point reached as a result of the chemical transformation carried out by nature is life. Enzymes are responsible biomolecules for the chemical transformation that makes life possible. People had benefited from the reactions carried out by enzymes to obtain various products in many fields throughout history, from the times when they did not know the existence of these catalysts. Over time, people had understood how great potential these biocatalysts have with the structure and working principles. Since then the characterisation of novel enzymes and the usage area of these enzymes have been expanded day by day. Today, more than 3.000 enzymes are used in biotechnological and industrial fields and it is reported that the size of this enzyme market has reached 6 billion USD in 2021. The enzymes that dominate this market with a share of 30 % are those used in the food and beverage industry and the ones that have the upper hand in this group are the enzymes used in starch processing applications. Starch, the main component of many agricultural products and the primary source of carbohydrates for most people, is the main source of carbon in the world. In addition to starch, oligosaccharides, disaccharides and monosaccharides obtained as a result of hydrolysis are also used in various fields such as food, pharmaceuticals and biofuels. To obtain these hydrolysis products, starch is subjected to a three-step process: gelatinisation, liquefaction and saccharification. The viscous solution which is obtained by hydrolysis of α-1,4- and α-1,6- glycosidic bonds in the starch structure and gelatinisation is achieved by using α-amylase, β-amylase, glucoamylase and pullulanase enzymes during the liquefaction. During all these processes to remain the enzymes stable for a long time and maintain their activity, pH adjustment and the addition of Ca2+ ionsare required . Remove both the formed salt as a result of pH adjustments and excess Ca2+ ions causes additional steps and all of these lead to an increase in the cost of production. To eliminate these steps and perform a one-step liquefaction-saccharification process can be possible with an alternative enzyme. Amylopullulanases (E.C. 3.2.1.1/41) are enzymes capable of hydrolysing both α-1,4- and α-1,6- glycosidic bonds, while those obtained from extremophilic organisms can maintain their activities under harsh industrial conditions. In this study, the amylopullulanase (TbbApu) enzyme belonging to the Thermoanaerobium brockii brockii organism, is one of the strong candidates for starch hydrolysis processes, is examined. Previously, for the recombinant production of TbbApu, the whole apu gene had been obtained by using the primary walking method by our group and the optimisation of expression studies was in progress. As a result of the studies, pET-28 a (+) vector and E. coli BL21 (DE3) were chosen as the appropriate expression vector and and E. coli BL21 (DE3) the appropriate host, respectively. Additionally, the variants TbbApuΔSH3 without SH3 domain and TbbApuΔCBM20 without CBM20 domain were constructed to investigate the effect of SH3 and CBM20 domains. In the scope of this thesis, apart from TbbApuΔSH3 and TbbApuΔCBM20 variants, four additional truncated constructs namely TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1 and TbbApuΔX25-2-CBM20 were also obtained to disclose the effects of X25 domain. The biochemical characterisation, raw starch binding ability and kinetic studies of TbbApu and its six variants have been accomplished. The function of the X25 domain on substrate binding, activity and stability of the enzyme has been revealed for the first time with this study. The genes belonging to each construct were amplified by PCR with specific forward and reverse primers that have SacI and NotI restriction sites at their 5' ends and using the whole apu gene as a template. As a result of the amplification, tbbApuΔX25-1-SH3, tbbApuΔX25-2-SH3, tbbApuΔX25-1-CBM20 and tbbApuΔX25-2-CBM20 genes with a length of 4065, 3750, 3375 and 3060 base pairs, respectively, were obtained. Then, the obtained genes and the pET-28 a (+) expression vector were cut with SacI and NotI enzymes to form sticky ends and the ligation reactions were set up for the insertion of the genes into the pET-28 a (+) expression vector. Then, transformation was performed using competent E. coli BL21 (DE3) host cells. For the determination of positive colonies from the colonies obtained as a result of the transformation, half of the colonies were inoculated on agar plates containing red pullulan. 1 µM IPTG and 40 µg/mL kanamycin were also included in the agar plate for induction and selection respectively. For the control of detected positive colonies from the PRR plate, the other half of the colonies were inoculated into Luria-Bertani (LB) medium and plasmid isolation was performed from these cells. Then, the isolated plasmids were cut with FastDigest SacI enzyme and linearised to determine the length of the plasmids. By linearisation, tbbApuΔX25-1-SH3 - pET-28 a (+) vector with a length of 9434 base pairs; 9119 base pairs long tbbApuΔX25-2-SH3 -pET-28 a (+) vector, 8744 base pairs tbbApuΔX25-1-CBM20- pET-28 a (+) vector and 8429 base pairs tbbApuΔX25-2-CBM20- pET-28 a (+) vector were obtained from all selected colonies. After the cloning, TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20, TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 and TbbApuΔX25-2-CBM20 were over-expressed using magic media. To purify these recombinant enzymes, purification was achieved in three steps by using metal affinity chromatography, ion exchange chromatography and heat purification respectively. Then, the pullulanase and α-amylase activities of TbbApu and its six variants were checked by the red pullulan and starch-containing polyacrylamide gel. The biochemical characterisation of the enzymes was completed. As a result of the studies, the optimum reaction temperature for pullulanase activities was determined as 70 °C for TbbApu, TbbApuΔSH3 and TbbApuΔCBM20, 75 °C for TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3 and TbbApuΔX25-1-CBM20 and also 80 °C for TbbApuΔX25-2-CBM20 domain. The optimum reaction temperature for α-amylase activities was specified as 75 °C for TbbApu, TbbApuΔSH3 and TbbApuΔCBM20, and 80 °C for TbbApuΔX25-1-SH3, TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 and TbbApuΔX25-2-CBM20. The pure variants were incubated for 24 hours at variable temperatures to examine the effect of temperature on the stability of enzymes. It was observed that the most stable temperature of 60 °C for TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20, TbbApuΔX25-1-SH3 and TbbApuΔX25-2-SH3, 50 °C for TbbApuΔX25-1-CBM20 and 40 °C for TbbApuΔX25-2-CBM20. Optimum pH values for both activities were found to be 6.5 for TbbApu, TbbApuΔX25-1-SH3 and TbbApuΔX25-1-CBM20, 6 for TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20 and TbbApuΔX25-2-SH3, and 7 for TbbApuΔX25-2-CBM20. It has been determined that the enzymes reached 80 % of their α-amylase activities with pH 5 and protected it up to pH 8. When the effects of different pH values on the stability of the enzymes were examined, the most stable pH according to pullulanase activities was found as pH 4 for TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20 and TbbApuΔX25-2-CBM20, pH 6 for TbbApuΔX25-2-SH3, pH 6.5 for TbbApuΔX25-1-SH3 and TbbApuΔX25-1-CBM20 after 24 hours of incubation. According to their α-amylase activities, the most stable pH was found as pH 3 for TbbApu, TbbApuΔSH3, TbbApuΔCBM20, pH 6 for TbbApuΔX25-2-SH3, TbbApuΔX25-1-CBM20 and TbbApuΔX25-2-CBM20, pH 7 for TbbApuΔX25-1-SH3. In addition, it is represented that TbbApu and its variants can maintain their stability between pH 3 and 8 and TbbApu can be used in starch hydrolysis processes without pH adjustment. When the effect of metal ions was examined, while Mn2+ and Co2+ ions increased both pullulanase and α-amylase activities of TbbApu and its variants whereas, Mg2+, Zn2+ and Al3+ ions decreased both activities of all enzymes except pullulanase activity of TbbApuΔCBM20 variant. Although α-amylase enzymes used in starch processing are Ca2+ ion-dependent, TbbApu and its variants are not dependent on Ca2+ ion for activity and stability, making the enzyme and its variants a strong candidate for starch hydrolsis process. Also, in the presence of 20 % and 50 % hexane and acetone, with some exceptions, both activities of TbbApu and its variants were increased and 20 % and 50 % butanol, DMF and DMSO presence strongly inhibited both activities of the enzymes. When the effects of organic solvents on the stability of enzymes were examined, it was observed that, with some exceptions, the stability of the enzymes increased in the presence of 20 % and 50 % acetone and hexane, compared to both pullulanase and α-amylase activities, after 24 hours of incubation. In the case of inhibitors and detergents, it was observed that inhibitors moderately inhibited pullulanase and α-amylase activities of TbbApu and its variants with some exceptions, whereas all inhibitors increased the pullulanase activity of TbbApuΔCBM20 and nonionic and anionic enzymes inhibited both activities moderately with. However, the activities of all enzymes were strongly inhibited in the presence of CTAB, which is a cationic detergent. Then, the kinetic parameters of the enzymes were elucidated. The results imply that, truncation SH3 domain improves both α-amylase and pullanase activities of the enzyme. However, truncation of CBM20 and X25 domains from TbbApu caused to loss of affinity and specificity of the enzyme to soluble starch and to shift in the specificity of the enzyme to pullulan. The removal of the SH3 domain and also CBM20 domain, the carbohydrate-binding module in the enzymes did not have any effect on the raw starch binding capacity of TbbApu. The removal of the SH3 domain and also CBM20 domain, the carbohydrate binding module in the enzymes did not have any effect on the raw starch binding capacity of TbbApu. However, sequential removal of X25 and SH3 domains resulted in 27.3 % and 58.4 % reduction in raw starch binding ability, while removal of CBM20 and X25 domains resulted in a 90 % decrease in raw starch binding ability. Thus, it was revealed that the X25 domain is involved in binding raw starch. The results of TLC analysis represented that TbbApu and its variants released maltotriose and maltose as a result of pullulan hydrolysis and maltotriose starch hydrolysis, respectively. The results of TLC analysis represented that TbbApu and its variants released maltotriose and maltose in pullulan hydrolysis and maltotriose in starch hydrolysis, respectively.
Benzer Tezler
- Cloning, expression and biochemical characterization of full size and truncated novel CCDC-124 protein in e. coli
E.coli'de tam boyutlu ve kesilmiş yeni CCDC-124 proteinin klonlaması, ekspresyonu ve biyokimyasal özellikleri
ASYAH ABBAS ABBOOD ABBOOD
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜNİR TUNÇER
- Dissecting the mechanism of Arp2/3 complex activation by actin filament binding and the regulation and function of JMY in cells
Başlık çevirisi yok
ELİF NUR FIRAT
Doktora
İngilizce
2010
BiyolojiUniversity of California BerkeleyMoleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. MATTHEW D. WELCH
- Heterotrimeric G-protein alpha (α) subunit from A. thaliana (AtGPA1)) forms trimeric structures in solution
A. thaliana G-proteini alfa (α) altbirimi (AtGPA1) bulunduğu ortamlarda trimerik yapılar oluşturur
ERSOY ÇOLAK
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
BiyofizikSabancı ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEHRA SAYERS
- Bazı böğürtlen çeşitlerinin farklı olgunlaşma dönemlerinde biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi
Biochemical characterisation of some blackberry varieties at different maturation
BETÜL YEŞİL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
ZiraatÇukurova ÜniversitesiBahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NESİBE EBRU KAFKAS
- Ordu ili ve ilçelerinden toplanan toprak numunelerinden Bacillus sp. suşlarının izolasyonu ve insektisidal etkilerinin belirlenmesi
Determination of insecticidal effects and isolation of Bacillus sp. strains collected from soil samples in Ordu provience and towns
DUYGU ODABAŞ