Characterization of BAG-1S/C-raf interaction targeting peptide
BAG-1S/C-raf etkileşimini hedefleyen peptitin karakterizasyonu
- Tez No: 767970
- Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 66
Özet
Kanser dünya çapında ölümlerin en büyük sebeplerinden birisidir. Kanser hücreleri, sürekli çoğalma, vücudun başka bölümlerine metastaz yapma, hücre ölümüne karşı direnç gibi değişik özelliklere sahiptir. Bu özellikler hücresel yolakların düzensizliği yüzünden kaynaklanır ve devam ettirilir. Ras/Raf/MEK/ERK yolağı bu yolaklarlardan bir tanesidir. Ras/Raf/MEK/ERK yolağı (ERK yolağı), hücre çoğalması, migrasyonu, farklılaşması ve apoptoz gibi birçok farklı fizyolojik işlevi düzenleyen en önemli hücresel yolaklardan birisidir. Birçok hücresel fonksiyonda hayati rolleri olduğundan, üyelerinin düzensizliği genellikle meme kanseri gibi kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalmasına ve gelişmesine neden olur. Ras ve Raf serin/treonin protein kinazlar, bu yolağın çoğunlukla mutasyona uğrayan bileşenleridir ve her iki proteindeki mutasyonlar, tüm insan kanser türlerinin yaklaşık üçte birinde tanımlanmıştır. Raf kinazlara karşı geliştirilen birçok terapötik olmasına rağmen zaman içinde hastalar bu ilaçlara karşı direnç geliştirmektedir. İlaç direncinin artması nedeniyle de, yeni kanser ilaçlarının geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Ortaya çıkan ilgi alanlarından biri, kanserlerle ilgili protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) hedeflemektir. Bu etkileşimleri hedeflemek için genelde yapısal biyoloji çalışmalarından yararlanılır ve küçük moleküller ya da peptidler tasarlanır. Raf kinazlar (C-Raf ve B-Raf) ERK yolağının en önemli üyeleri olarak düşünülmektedir. İnsan Raf kinaz ailesinin üç izoformu vardır: A-Raf, B-Raf ve C-Raf. Kanser hücrelerinde çoğunlukla B-Raf mutasyona uğramasına ve düzensiz olmasına rağmen, C-Raf apoptozu baskılama yeteneğine sahiptir ve Ras-onkogen kanserlerde kanser oluşumu C-Raf üzerinden gerçekleşmektedir. Bu nedenle her iki Raf kinaz da kanser gelişmesi ve ilerlemesi için hayati öneme sahiptir. Raf kinazların stabilizasyonu ve aktivasyonu, domenlerindeki farklı fosforilasyon olayları tarafından ve ayrıca BAG-1 gibi bazı proteinlerle etkileşimleri tarafından düzenlenirler. Anti-apoptotik bir ko-şaperon proteini olan Bcl-2 ile ilişkili athanogen 1 (BAG-1), genellikle onkoprotein olarak çeşitli kanser türlerinde aşırı ifade edilir. İnsan BAG-1 proteinin ana 3 izoformu (BAG-1L, BAG-1M ve BAG-1S) bulunmaktadır ve bu 3 BAG-1 izoformu alternatif başlangıç tanslasyonu yoluyla tek bir mRNA'dan üretilmektedir. BAG-1 ve C-Raf arasındaki etkileşimin, C-Raf proteininin aktivasyonunu ve stabilizasyonunu desteklediği bilinmektedir. Ayrıca bu etkileşimin kanser hücrelerine uzun süreli sağkalımda da yarar sağladığı bilinmektedir. Bu nedenle, bu etkileşimin küçük moleküller ve/veya peptitler ile hedeflenmesi, BAG-1 proteinin aşırı ifade edildiği ve/veya Ras'ın düzensiz olduğu ve kanser hücrelerinin C-Raf üzerinden sağkalımı sağladığı kanser türlerine karşı etkili terapötikler geliştirilmesine olanak sağlayacaktır. Daha önceki çalışmalarımızda BAG-1S ve C-Raf arasındaki etkileşim yüzeyi belirlenmiş ve C-Raf'ın doğal dizisinden BAG-1S'ye karşı Pep3 kodlu bir peptidomimetik tasarlanmıştır. Pep3 peptidinin in vitro çalışmalarda BAG-1S ve C-Raf arasındaki etkileşimi bozduğu görülmüştür. Bu çalışmanın amacı, BAG-1S ile Pep3 arasındaki etkileşimi ve ayrıca BAG-1S ile Pep3'ün hücreye girebilen formu olan TPep3 arasındaki etkileşimi karakterize etmektir. Pep3 hidrofobik ve negatif yüklü bir peptid olduğu için hücre içine girebilen bir form değildir. Bu yüzden Pep3'ün N ucuna amino asitler eklenmiş ve hücreye girebilen formu (TPep3) tasarlanmıştır. İlk olarak, memeli ve bakteri hücrelerinde His-etiketli BAG-1S proteinleri üretilmiş ve daha sonra, BAG-1S proteinleri, iki aşamada Ni-NTA afinite saflaştırması ile saflaştırılmıştır. İlk adımdan sonra His-tag, TEV proteaz ile kesilmiş ve etiketsiz proteinler, ikinci adımda resine bağlanmamış olarak toplanırken, safsızlıklar ve TEV proteazlar resine bağlı kalmıştır. Daha sonra her iki saflaştırılmış proteinin (memeli ve bakteride üretilen) saflıkları SDS-PAGE ile >%80 olarak hesaplanmıştır. Proteinlerin ikincil yapı analizi sirküler dikroizm ile yapılmış ve 208 nm ve 222 nm'de minimum değerler gözlenmiştir. Bu sonuçlar, saflaştırılmış iki BAG-1S proteininin de katlı olduğunu ve ɑ-heliks özellikleri gösterdiğini belirtmektedir. BAG-1S proteinleri karakterize edildikten sonra. Pep3 ve TPep3 karakterizasyonu, kütle spektrometrisi ve sirküler dikroizm analizi ile gerçekleştirilmiştir. Pep3 ve TPep3, Fmoc bazlı katı faz peptit sentezi ile sentezlenmiştir. Pep3 hidrofobik olduğu için su yerine 20 mM AMBIC içinde çözülmektedir. TPep3 peptidi ise hidrofilik özellikler gösterdiği için su içinde çözülmüştür. Peptitlerin moleküler ağırlıkları Pep3 için 2.066 kDa ve TPep3 için 3.653 kDa olarak hesaplanmıştır. Bu değerler teorik olarak hesaplanan değerlerle uyum içinde olduğu içi peptitlerin doğru bir şekilde sentezlendiği kontrol edilmiştir. Peptitlerin ayrıca ikincil yapıları sirküler dikroizm yöntemi ile de kontrol edilmiştir. Pep3 %30 oranında β-tabaka özellikleri ve düzensiz sargı özellikleri göstermektediri. TPep3 peptiti de aynı şekilde çoğunlukla düzensiz sargı özellikleriyle birlikte β-tabaka özellikleri de göstermektedir. BAG-1S ve peptitler arasındaki etkileşim, orta uzunlukta çapraz bağlayıcı DSS (disüksinimidil suberat) kullanılarak çapraz bağlama reaksiyonu ile doğrulanmıştır. Çapraz bağlama reaksiyonu kimyasal bir şekilde iki bağın kovalent olarak birbirine bağlanmasıdır. BAG-1S proteinleri, etkileşim oluşturmak için peptitler ile ayrı ayrı inkübe edilmiş ve etkileşim oluşturduktan sonra çapraz bağ reaksiyonu, 50 kat molar fazla DSS ile kurulmuştur. Reaksiyonlar immünoblotlama ile analiz edilmiştir. Sadece BAG-1S reaksiyonuna kıyasla Pep3 ile etkileşime girdiğinde BAG-1S proteini SDS-PAGE analizinde 2 kDa yukarıda yürümüş ve TPep3 ile etkileşime girdiğinde 4 kDa yukarıda yürümüştür. Bu yukarıda yürümeler peptitlerin ağırlıklarıyla uyumlu olduğu için BAG-1S proteininin peptitler ile etkileşimini doğrulamıştır. BAG-1S proteininin Pep3 ve TPep3 peptitleri varlığındaki stabilitesi kısıtlamalı tripsinoliz yöntemi ile ölçülmüştür. BAG-1S proteini peptitler ile birlikte etkileşim kurması için inkübe edilmiştir. Daha sonra peptitlerin varlığında ve yokluğunda tripsin enzimi ile kesilmiştir. Tripsin enzimi ile kesilirken belli zaman sürelerinde tripsinli tüplerin içinden örnekler alınmış ve Laemmli ile reaksiyon susturulmuştur. Daha sonra immünblotlama yöntemi ile analiz edilmişlerdir. BAG-1S proteinlerinin her iki peptitin varlığında da tripsin ile tamamen kesilme süresinin uzadığı görülmüştür. Bu da BAG-1S proteininin her iki peptitle de etkileşimde olduğunu doğrulamış ve peptitlerin varlığında BAG-1S proteininin stabilitesinin arttığını söylemiştir. İki peptidin sadece BAG-1S protein örnekleri analiz edildiğine Pep3 proteininin kontrol örneğinin daha hızlı tripsinle kesildiği gözlenmiştir. Pep3 peptitli örneğin kontrolü olan sadece BAG-1S proteinine Pep3 20 mM AMBIC ile çözüldüğü için diğer örneğe eklenen peptid miktarı kadar 20 mM AMBIC eklenmiştir. Tripsin enziminin de AMBIC varlığında aktivitesinin arttığı bilinmektedir. Bu yüzden iki BAG-1S arasındaki farkın AMBIC varlığında artan tripsin aktivitesi yüzünden olduğu düşünülmektedir. BAG-1S ve Pep3'ün bağlanma kinetiği, çok döngülü kinetik yöntemiyle Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) ile ölçülmüştür. SPR iki molekül arasındaki bağlanma kinetiğini ve kinetik parametreleri ölçebilmeye yarayan bir yöntemdir. Bu deney için Protein G çipi kullanılmıştır. Öncelikler Anti-BAG-1 çipin üzerine kaplanmıştır. BAG-1S proteinleri Anti-BAG-1 yardımı ile çipin üzerine tutturulmuş ve daha sonra 500 nM'Dan 4000 nM'a kadar değişen konsantrasyonlarda Pep3 çipin üzerine enjekte edilmiştir. Belli bir süreden sonra enjeksiyon kesilmiş ve sonuçlar üzerinden bağlanma kinetiği hesaplanmıştır. Ayrıca artan Pep3 konsantrasyonlarında cihazdan alınan 'Response' değerlerinin de arttığı görülmüştür. Bu sonuç BAG-1S ve Pep3 arasındaki etkileşimin ikincil doğrulaması yerine de geçmektedir. Pep3 ve BAG-1S arasındaki bağlanma kinetiği 1:1 bağlanma modeli ile 68.56 nM olarak hesaplanmıştır. Bu değer nM seviyesinde olduğu ve 100 nM'ın da altında olduğu için Pep3 ve BAG-1S arasındaki etkileşimin yüksek afinite ile gerçekleştiği söylenebilmektedir. TPep3 peptidi daha önce de söylendiği gibi Pep3 peptidinin N ucuna amino asit eklenmesiyle yeniden tasarlanmıştır ve hücre membranından geçebilme özelliğine sahiptir. TPep3'ün MAPK yolu üzerindeki etkileri ve MCF-7 meme kanseri hücrelerinin hücre canlılığı analiz edilmiş ve IC50 değeri hesaplanmıştır. MCF-7 hücrelerinde BAG-1 proteininin aşırı ifade edildiği bilinmektedir ve bu yüzden bu çalışma için MCF-7 hücre hattı kullanılmıştır. TPep3 peptitinin IC50 değeri MTT analizi ile 18 uM olarak hesaplanmıştır. Sonrasında MCF-7 hücreleri, farklı konsantrasyonlarda (0 uM ila 50 uM) TPep3 ile muamele edilmiş ve peptitle birlikte 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra hücre proteinleri, immünoblotlama yöntemi ile analiz edilmiştir. TPep3 ile muamele edildikten 24 ve 48 saat sonrasında, artan TPep3 konsantrasyonu ile C-Raf ve p-C-Raf (S338) seviyelerinin azaldığı gözlenmiştir. Azalan p-C-Raf aktivitesinin sonucunda, p-MEK seviyelerinin de azaldığı gözlenmiş ve bu da ERK yolağındaki aktivitenin azaldığını göstermiştir. Ayrıca B-Raf ve p-B-Raf (S446) seviyelerinde de düşüş görülmüştür. Dolayısıyla peptidin sadece C-Raf aktivasyonunu etkilemediği, aynı zamanda B-Raf'ın aktivasyonunu da etkilediği söylenebilmektedir. 24 ve 48 saat analizlerinin aksine, TPep3 peptitdi ile inkübasyondan 72 saat sonra, p-C-Raf, C-Raf ve p-MEK seviyelerinin normale dönmeye başladığı ve peptitin etkisini kaybetmeye başladığı gözlenmiştir. Bunun sebebi olarak da iki olasılık düşünülmüştür: peptitin yarı ömrü kısa olduğu için peptit 48. saatten sonra etkisini kaybetmeye başlamıştır ya da C-Raf proteininin stabilizasyonu ve aktivitesi sadece BAG-1 proteini üzerinden düzenlenmediği için hücre 48. saatten sonra kendisini düzenlemek için diğer proteinleri ve yolakları aktive etmeyye başlamış olabilir. Son olarak TPep3'ün diğer hücre yaşam yolakları üzerindeki etkilerini görmek için Akt ve p-Akt (S473) seviyeleri analiz edilmiş ve en yüksek peptit konsantrasyonunda bile seviyelerinin neredeyse değişmediği görülmüştür. Son olarak, hücre canlılığı MTT deneyiyle ölçülmüş ve artan peptit konsantrasyonlarında hücre canlılığının azaldığı görülmüştür. Sonuç olarak Pep3 ve BAG-1S arasındaki etkileşimin yüksek afinitede gerçekleştiği gözlenmiş ve BAG-1S proteinin stabilitesinin TPep3 ve Pep3 varlığında stabilitesinin arttığı görülmüştür. Ayrıca TPep3 peptiti MCF-7 hücrelerinde 48 saate kadar ERK yolağının aktivitesinin azalmasına neden olmuştur. Tüm bu sonuçlar TPep3 peptitinin terapötik amaçlarla kullanabilme olasılığı olduğunu göstermiştir. Sonraki çalışmalar için farklı kanser hücreleri ve kombine terapiler kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
ERK/MAPK cascade is one of the most important cellular pathways, which regulates many distinct physiological functions such as cell proliferation, migration, differentiation, and apoptosis. Since it has vital roles in many cellular functions, dysregulation of its members usually results in uncontrolled proliferation and development of cancer cells such as breast cancer. Ras and Raf serine/threonine protein kinases are mostly deregulated components of this pathway and mutations in both proteins have been identified approximately one-third of all human cancer types. Although there are several inhibitors against oncoproteins, because of the improving drug resistance, there is a need for the development of new drugs. One of the emerging interest is to target protein-protein interactions (PPIs) related with cancers. Human Raf kinase family has three isoforms: A-Raf, B-Raf, and C-Raf. C-Raf and B-Raf are the important members of ERK pathway. Although B-Raf is dysregulated mostly, C-Raf has ability to suppress apoptosis and hence, both of the Raf kinase is vital for the cancer progression. The Raf kinases are regulated by several phosphorylation events and also, interactions with some proteins like BAG-1. Bcl-2 associated athanogene 1 (BAG-1) which is an anti-apoptotic co-chaperone protein is usually overexpressed in several cancer types making it possible oncoprotein. Moreover, its known that the interaction between BAG-1 and C-Raf promotes the C-Raf activation and stabilization. Therefore, targeting this interaction with small molecules and/or peptides would be effective therapeutics against different cancer types. In our previous studies, the interaction surface between BAG-1S and C-Raf was determined and a peptidomimetic which coded as Pep3 was designed against the BAG-1S from natural sequence of C-Raf. The aim of this study was to characterize the interaction between BAG-1S and Pep3 and also, the interaction between BAG-1S and TPep3 which is cell penetrating form of Pep3. Firstly, His-tagged BAG-1S proteins were produced in mammalian and bacterial cells. Then, BAG-1S proteins were purified by Ni-NTA affinity purification in two steps. After first step, His-tag was cleaved with TEV protease and tagless proteins were eluted as flow-through in second step while the impurities and TEV proteases were remained bound to resin. Then, the purities of both proteins (produced in mammalian and bacterial) were calculated as >80% by SDS-PAGE. Secondary structure analysis of proteins was performed with circular dichroism and both of the proteins has been folded and showed primarily ɑ-helix characteristics. After BAG-1S proteins were characterized. Pep3 and TPep3 characterization were performed by mass spectrometry and circular dichroism analysis. Pep3 and TPep3 has been synthesized by Fmoc-based solid phase peptide synthesis and they were dissolved in 20 mM AMBIC and water respectively since the Pep3 shows hydrophobic characteristics. Molecular weights of peptides were measured as 2.066 kDa for Pep3 and 3.653 kDa for TPep3 which were compatible with the theoretical calculations. Both of the peptides showed β-sheet characteristics approximately 30% combined with random coils. The interaction between BAG-1S and peptides were confirmed by crosslinking reaction with medium length crosslinker DSS (disuccinimidyl suberate). BAG-1S proteins were incubated with peptides separately to form interaction. After they formed interaction, the crosslink reaction was performed with 50-fold molar excess of DSS. The reactions were analyzed by immunoblotting. BAG-1S was shifted 2 kDa when interacts with Pep3 and 4 kDa with TPep3 comparing to the BAG-1S only reaction. These results were confirmed the interaction of BAG-1S with two peptides. The binding kinetics of BAG-1S and Pep3 was measured by Surface Plasmon Resonance (SPR) with multi-cycle kinetics method. BAG-1S protein was captured on Protein G chip with Anti-BAG-1 and different concentrations of Pep3 was injected. Binding kinetics was calculated as 68.56 nM by 1:1 binding model showing that Pep3 binds BAG-1S with high affinity. The effects of TPep3 on MAPK pathway and cell viability of MCF-7 breast cancer cells were analysed. MCF-7 cells were treated with different concentrations (0 uM to 50 uM) of TPep3 and total proteins were analysed with immunoblotting. C-Raf and p-C-RAf (S338) levels were decreased with the increasing concentration of TPep3. As a result of p-C-Raf inactivation, p-MEK levels were also decreased which showed the decrease in ERK pathway. Moreover, B-Raf and p-B-Raf (S446) levels were decreased. So, it can be said that peptide does not only affect the activitation of C-Raf but also B-Raf. To see the effects of peptide on other cell survival pathways, Akt and p-Akt (S473) levels were analysed and it was seen that their levels remained unchanged even with the highest peptide concentration. Lastly, the IC50 value was calculated as approximately 18 uM from the cell viability MTT assay. Together with all the results, TPep3 and Pep3 peptides have potential to be a promising therapeutics for cancer types relying on ERK pathway since the activity of pathway was decreased with the peptide treatment.
Benzer Tezler
- Synthesis, photophysical properties and ofet application of thienothiophene and benzothiadiazole based donor-π-acceptor-π (D-π-A-π) type conjugated polymers
Tiyenotiyofen ve benzotiyadiazol esaslı donör-π-alıcı-π (D-π-A-π) tipi konjuge polimerlerin sentezi, fotofiziksel özellikleri ve ofet uygulaması
SERRA EBRU ÖZTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Kimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK
- Katkılandırılmış grafen temelli polimer kompozit elektrotların hazırlanması, modifiye edilmesi: Elektrokimyasal uygulamaları ve karakterizasyonu
Preparation and modification of additive graphene based polymer composite electrodes: Elektrochemical applications and characterizations
MÜRŞİDE CEREN AFŞAR
- 3-dimensional boron-doped hydroxyapatite/baghdadite porous scaffolds for bone tissue engineering
Kemik doku mühendisliği için 3-boyutlu boron katkılı hidroksiapatit/bağdadit gözenekli iskeleler
HOSSEIN JODATI
Doktora
İngilizce
2023
BiyomühendislikOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZAFER EVİS
PROF. DR. VOLKAN ŞAHİN
- Vacuum infusion (VI) process modeling and material characterization with viscoelastic compaction models
Viskoelastik sıkıştırma modelleri ile malzeme karakterizasyonu ve vakum infüzyon (VI) işlemi modellemesi
BEKİR YENİLMEZ
Doktora
İngilizce
2014
Makine MühendisliğiKoç ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ERCÜMENT MURAT SÖZER
- Ege bölgesi bağ alanlarında saptanan grapevine yellow speckle viroid-1 ve 2 (GYSVd-1 ve 2)'nin moleküler karakterizasyonu
Molecular characterization of grapevine yellow speckle viroid-1 and 2 detected in the Aegean region vineyards
AYŞE ÇANDAR
