The quantification of fibrosis in cleared human and mouse liver tissues by light-sheet fluorescence microscope using a slide-free approach
Fibrozun şeffaflaştırılmış insan ve fare karaciğer dokularında slaytsız bir yöntem kullanarak ışık tabakalı floresan mikroskobu ile kantifikasyonu
- Tez No: 767958
- Danışmanlar: PROF. DR. MÜJDAT ZEYBEL
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Gastroenteroloji, Gastroenterology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Sağlık Bilimleri Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 170
Özet
Plan ve amaç: Karaciğer fibrozu, her türlü karaciğer hasarında gelinen ortak bir son noktadır. Karaciğer biyopsisi, fibroz derecesini belirlemek ve ardından hastalara uygun tedaviyi sağlamak için kullanılan tek güvenilir yöntemdir. Ancak, karaciğer biyopsisinin bazı sınırlamaları vardır. Numune alma hatası, gözlemci değişkenliği ve yarı kantitatif değerlendirme, hepatik fibrozun doğru şekilde değerlendirilmesini sınırlandırabilecek yöntemin önemli bir kısıtlamalarıdır. Buna ek olarak, küçük parça numunelerin kullanımı da derecelendirme yanlışlığını artırabilir. Hepatik fibroz değerlendirmesindeki sorunlar, özellikle NASH klinik çalışmalarında etkili biyobelirteçlerin ve terapötiklerin gelişimini sınırlandırmaktadır. Şeffaflaştırılan karaciğer biyopsinin kesit alınmadan değerlendirilmesi, karaciğer fibrozunun doğru şekilde tayinine yardımcı olabilir. Bu amaçla, insan ve fare karaciğer dokularında hepatik fibrozun miktarını belirlemek için modifiye edilmiş CLARITY ve özel olarak üretilmiş bir ışık tabakalı floresan mikroskop kullanarak bir platform geliştirdik. Materyal ve yöntem: Bu çalışmaya insan gönüllülerinden yüz altmış sekiz karaciğer örneği dahil edilmiştir. Kohort elli yedi NAFLD, otuz sekiz viral hepatit hastası ve on üç iyi huylu karaciğer hastalıkları nedeniyle hepatik rezeksiyon geçirmiş olguyu içeriyor. Sirius-Red boyalı fare ve insan karaciğer kesitleri, karaciğer fibrozunun 2B değerlendirilmesi için uzman patolog tarafından incelenmiş ve kolajen orantısal alan (CPA) ölçümleri hesaplanmıştır. Karaciğer numuneleri, modifiye ediliş CLARITY yöntemi kullanılarak temizlenmiş ve özel olarak hazırlanmış bir ışık levhası mikroskopuyla görüntülenmiştir. Yöntemin fibrozun ara aşamalarında uygulanabilirliğini test etmek için C57Bl/6 farede beş farklı karaciğer hastalığı modeli geliştirilmiştir. Kollajen tip I ve Elastin proteinleri, özel olarak hazırlanmış ışık tabakalı mikroskop aracılığıyla kesitsiz bir yaklaşım kullanılarak, temizlenmiş insan karaciğer dokularında miktarları belirlenmiştir. Kolajen orantılı hacmi (CPV) ve elastin orantılı hacmi (EPV) hesaplamak için tüm karaciğer numunelerinin birden fazla optik kesit kullanılmıştır. Bulgular: Bu projede hepatik fibrozun volümetrik değerlendirilmesi için şeffaf karaciğer dokuları elde ettik. Modifiye edilmiş CLARITY yöntemi, insan ve fare karaciğer dokularını etkili bir şekilde şeffaflaştırmıştır. Karaciğer fibrozunda en çok üretilen ECM proteinleri, kolajen tip I ve Elastin, insan NAFLD ve viral hepatit kohortlarında miktarları belirlenmiştir. CPV ve EPV kesme değerleri, insan NASH kohortunda her bir fibrotik aşama için belirlenmiştir. Analizler, volümetrik görüntüleme verilerinin optik kesitleri arasında önemli kesitsel değişkenlik olduğunu göstermiştir. Varyasyon katsayısı analizi varyasyon derecesini belirlemiş ve F3-4 NAFLD gruplarının CPV ve EPV kesitleri için %84.6 ara ve yüksek seviyeli varyasyon bulmuştur. CPV ve EPV için belirlenmiş kesme değerlerine sahip optik kesitlerinin 3B derecelendirmesi, optik kesitlerinin yalnızca %44 ve %47'sinin F3 ve F4 için aynı şekilde derecelenebileceğini göstermiştir. Sonuç: Özel olarak üretilmiş bir ışık tabakalı mikroskop kullanarak hepatik fibrozun 3B patolojisini değerlendirmek için slaytsız bir yöntem geliştirdik. Tüm karaciğer biyopsileri hacimsel görüntü analizi, biyopsi içinde önemli heterojenite olduğunu ortaya çıkardı. Hepatik fibrozda hücre dışı matriks proteinlerinin kapsamlı profillemesi ve kesitsiz ve tahrip etmeyen bir yöntemle miktarının belirlenmesi derecelendirme doğruluğunu artırabilir. Bu nedenle, bu yöntemin kullanılması NASH klinik çalışmalarına katkı sağlayabilir.
Özet (Çeviri)
Background & Aim: Liver fibrosis is a common end point of any type of liver injury. Liver biopsy is the only reliable modality for determining the extent of fibrosis and subsequently providing patients with appropriate treatment. However, liver biopsy is not without limitations. Sampling error, observer variability, and semi-quantitative assessment are the significant limitations of the procedure, which may limit the accurate assessment of hepatic fibrosis. Besides, the utility of such small samples increases the staging inaccuracy. Problems in assessment of hepatic fibrosis limit the development of effective biomarkers and therapeutics particularly in NASH clinical trials. A slide-free examination of optically cleared liver biopsy samples may assist in accurate quantification of hepatic fibrosis. To this end, we developed a platform for quantifying hepatic fibrosis in human and mouse liver tissues utilizing a modified-CLARITY and custom-made light sheet fluorescence microscope. Material and Method: A hundred and sixty-eight liver specimens from human subjects were included in this study. The cohort included fifty-seven NAFLD, thirty-eight viral hepatitis patients, and thirteen healthy subjects who underwent hepatic resection due to benign liver diseases. Sirius-red stained mouse and human liver sections were scored by an expert pathologist and Collagen proportionate area (CPA) analysed for 2D quantification of liver fibrosis. Liver specimens were cleared using the modified-CLARITY method and visualized with a custom-made light sheet microscope. To test the applicability of the method in intermediate stages of fibrosis, five animal models of liver disease were employed in C57Bl/6 mice. Collagen type I and Elastin were quantified in cleared human liver tissues using a slide-free approach via custom-made light sheet microscope. Multiple optical sections of whole liver samples were used to calculate collagen proportionate volume (CPV) and elastin proportionate volume (EPV). Results: In this project, we successfully obtained transparent liver tissues for volumetric quantification of hepatic fibrosis. The modified-CLARITY method efficiently cleared human and mouse liver tissues. The major ECM proteins, Collagen type I and Elastin, were quantified in the human NAFLD and viral hepatitis cohort. Cut-off values were determined for CPV and EPV values for each fibrotic stages of human NASH. Further analysis demonstrated substantial sectional variability between optical slices of volumetric imaging data. Coefficient of variation analysis determined the extent of variation and found 84.6% intermediate and high level variation for CPV and EPV sections of F3-4 groups of NAFLD. 3D fibrosis staging of optical sections with established cut-off values for CPV and EPV demonstrated that only 44% and 47% of optical sections would be staged the same for F3 and F4, respectively. Conclusion: We developed a slide-free method for assessing the 3D pathology of hepatic fibrosis using a custom-made light sheet microscope. Volumetric image analysis of whole liver biopsies revealed substantial heterogeneity within the biopsy. Comprehensive profiling of extracellular matrix proteins in hepatic fibrosis and quantification with a slide-free non-destructive platform may improve the staging accuracy. Thus, utilizing this method may advance the treatments for NASH clinical studies.
Benzer Tezler
- İnaktif taşıyıcı ve kronik hepatit B'li hastalarda hepatit B yüzey antijeninin kuantifikasyonu: Klinik ve histopatolojik ilişkisi
The quantıfıcatıon of hepatıtıs B surface antıgen ın ınactıve carrıers and chronıc hepatıtıs B patıents: clınıcal and hıstopathologıc correlatıon
TURGAY YILMAZ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2015
GastroenterolojiFırat Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İBRAHİM HALİL BAHÇECİOĞLU
- Kronik hepatit B'ye bağlı fibrozisin saptanmasında fibrotest ve elastografinin değeri
The value of fibrotest and elastography in the detection of fibrosis due to chronic hepatitis B
ESMA KARACA
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon HastalıklarıDicle ÜniversitesiEnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CELAL AYAZ
- Kronik hepatit b enfeksiyonu olan hastalarda serum kantitatif HBsAg düzeyi ile karaciğer histopatolojisi ve viral yük arasındaki ilişkinin araştırılması
Examination of relationship between serum quantitative HBsAg level and hepatic histopathology and viral load in patients with chronic hepatitis b infection
YASEMİN BALKAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2012
Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon HastalıklarıGaziantep ÜniversitesiKlinik Mikrobiyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA NAMIDURU
- Karaciğer fibrozisinin niceliksel değerlendirmesinde dijital görüntü incelemesi ve histopatolojik evrelemeler ile ilişkisi
A quantitative assessment of digital image analysis to measure fibrosis in liver biopsy specimens and relationship to knodell and ishak histopathological stagings
ENDER GÜNEŞ YEĞİN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2014
GastroenterolojiMarmara ÜniversitesiGastroenteroloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. OSMAN CAVİT ÖZDOĞAN
- The relationship between urinary exosomal miRNA levels and renal outcome in type 2 diabetic nephropathy patients
Tip 2 diyabetik nefropati hastalarında üriner eksozomal miRNA düzeylerinin renal outcome ile ilişkisi
MEHMET SEYİT ZOR
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI