Investigation of protonation state dependent conformational dynamics of the nucleotide binding domain of Hsp70 protein homolog Dnak via computational methods
Hsp70 protein homoloğu dnak'nin nükleotit bağlanma alaninin protonlanma haline bağli konformasyonel dinamiklerinin hesapsal yöntemlerle incelenmesi
- Tez No: 771654
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ BÜLENT BALTA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyofizik, Biyokimya, Biyoloji, Biophysics, Biochemistry, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 121
Özet
70 kDa ısı şok proteinleri (Hsp70) şaperon fonksiyonuna sahip, yaygın olarak bulunan ve korunmuş bir protein ailesidir. Bu proteinler, kısmi katlanmış veya yanlış katlanmış proteinlerin bir araya gelerek şekli belirsiz yığınlar oluşturmalarını önleyerek, proteinlerin katlanma süreçlerini denetlerler ve proteinlerin doğru bir şekilde katlanmalarına yardımcı olurlar. Yapısal olarak Hsp70'ler yaklaşık 45 kDa olan ve ATPaz aktivitesine sahip amino ucunda yer alan nükleotit bağlanma alanı (NBD) ve 25 kDa karboksilik asit ucunda yer alan ve substrat peptitlerinin bağlandığı cebi içeren substrat bağlanma alanından (SBD) oluşurlar. Ayrıca, bu iki alanı birbirine bağlayan korunmuş ve hidrofobik özellikte bağlaç bölgesi bulunmaktadır. Hsp70 proteinleri yalnız başlarına çalışmazlar. Bunun yerine, optimum düzeyde çalışmak için koşaperone adı verilen başka proteinlerin yardımlarına ihtiyaç duyarlar. 40 kDa ısı şok proteinleri Hsp40 (J-bölge proteinleri) ve nükleotit değişim faktörleri (NEFs) Hsp70 proteinleri tarafından gerek duyulan yardımcı proteinlerdir. Koşaperonlarla birlikte, Hsp70 proteinleri 3 üyeden oluşa Hsp70 makinelerini oluştururlar. Hsp70 şaperon sistemlerinin bütün işlevlerini yerine getirmeleri için, NBD ve SBD alanları fonksiyonel döngü boyunca birbirleriyle etkileşim kurmak zorundadırlar. Bu karşılıklı sinyal iletimi ve alanlar arası karşılıklı konuşma karmaşık bir“allosterik düzenleme”örneğidir. Temel olarak, NBD içindeki nükleotit durumu substrat ilgisini etkilemektedir. Buna karşılık, susbtrat proteinin SBD'ye bağlanması NBD'nin ATPaz aktivitesini harekete geçirir. NBD'nin ATP bağlı olduğu durumda, iki alan birbirlerinin üzerine gelir. Öte yandan, NBD'nin ADP bağlı olduğu veya boş olduğu durumlarda, bu iki alan birbirlerinden ayrılıp, birbirlerinden bağımız hale gelirler. Bu ayrılmış durumda, hidrofobik linker sayesinde bu iki alan birbirlerine bağlanır. NBD ve SBD'nin birbirleri üzerinde bulundukları ATP bağlı konformasyonda, substratların bağlanma ve ayrılma olayları ADP bağlı veya boş olan NBD durumlarına göre çok daha hızlı gerçekleşir. Bu yüzden, substrat bağlanma cebinin açık olduğu ATP bağlı durum“ düşük ilgi hali ”olarak adlandırılır. Bunun aksine, NBD'de herhangi bir nükleotit yokken veya NBD'ye ADP bağlandığı durumda substratların bağlanma ve ayrılma olayları çok daha düşük hızda gerçekleşir. Bu substrat bağlanma cebinin kapalı olduğu Hsp70 proteininin durumu ise“ yüksek ilgi hali ”olarak adlandırılmaktadır. Bütün bu sebeplerden ötürü, Hsp70ler açık ve kapalı durumlar arasında gidip gelmektedirler. Hidrofobik bağlaç segmenti Hsp70 şaperon sisteminin vazgeçilmez bir parçasıdır. Bağlaç bölgesi dinamik bir sinyal kolu fonksiyonu görerek NDB ve SBD alanları arasında NBD'den SBD'ye ve SBD'den NBD'ye doğru iki yönlü sinyal iletimini sağlar. Bu sayede iki alanın birbiriyle iletişim halinde kalmasını teşvik eder. Literatürde, bağlaç bölgesinin ve özellikle de bağlaç bölgesinin son 4 amino asit kalıntısı olan hidrofobik 388 VLLL 392 sekansının hem alanlar arası haberleşmede hem de ATPaz alanının dinamikleri üzerinde etkisi olduğunu ifade eden çalışmalarla doludur. Benzer şekilde, bağlaç bölgesi dışında, NBD'nin üzerinde pek çok amino asit kalıntısının Hsp70 döngüsünde anahtar roller üstlenmektedirler. Özellikle de, ATP'nin hidrolizlenmesi olayında bu kalıntılar önemli bir yer tutmaktadır. Bilhassa, E.coli bakterisinde bulunan Hsp70 homolog proteinindeki D8, K70, E171, D194, T199 ve D201 amino asit kalıntıları veya bu kalıntıların başka organizmaların Hsp70 homologlarındaki karşılıkları üzerinde durulmuş ve bazı çalışmalar yapılmıştır. Bu bilimsel çalışmada, E.coli bakterisinde bulunan Hsp70 homolog proteini DnaK'nin ATPaz aktivitesine sahip nükleotit bağlanma alanın (NBD) konformasyonel dinamikleri hesapsal simulasyon methodları kullanılarak detaylıca irdelenmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, kritik konumda olan amino asit kalıntılarının protonlanma hallerinin nükleotit bağlanma alanın açılma ve kapanma dinamikleri üzerindeki etkisi incelenmeye çalışılmıştır. Bunun için de başlangıçta açık ve kapalı olan farklı protonlanma halindeki nükleotit bağlanma cebi boş yapılar hazırlanmıştır. Farklı kombinasyonlarda D194, D201 ve H226 amino asit kalıntılarının protonlanma halleri değiştirilerek, +12, +13 ve +14 toplam yüküne sahip haller elde edilmiştir. Farklı 4 protonlanma hali şu şekilde hazırlandı: sadece D194 kalıntısı protonlanmış (194pr), sadece D201 kalıntısı protonlanmış (201pr), hem D194 kalıntısı hem de D201 kalıntısı protonlanmış (2pr) ve son olarak da ne D194 kalıntısı ne de D201 kalıntısı protonlanmış olacak (2dep) biçimde ayarlamalar yapıldı. Bu protonlanma halleri başlangıçta açık ve kapalı olan yapılar için ortak olarak seçilmiştir. Her bir durumda, ilgi duyulan bir başka amino asit kalıntısı olan H226 da protonlanmış formda alınmıştır. Taranan konformasyonal uzayı genişletmek ve bağlacın pozisyonunun NBD'ye katkısına bakmak amacıyla bağlacın bulunduğu konum elle düzenlenerek, bağlaç farklı noktalarda konumlandırılmıştır. Her biri 500ns uzunluğunda olan başlangıç olarak açık yapıyla başlatılan 1-392 DnaK yapılarının simulasyon sonuçlarına bakıldığında protonasyon halinin başlangıçta açık olan yapıları kapalıya doğru yönlendirmede önemli bir etkisinin olduğu farkedilmiştir. 194 numaralı aspartat amino asit kalıntısının protonsuz alındığı durumlarda (2dep ve 201pr), kapalılığın teşvik edildiği gözlenmiştir. Özellikle de 2dep yapısında simulasyonun ilk 200ns'lik periyodunun sonunda, açık olarak başlatılan yapının kapandığı görülmüştür. D194'ün protonlu olduğu durumda ise bahsedilen davranışın zıttı bir davranış olarak proteinin açıklığının devam ettiği hatta simülasyon süresince daha da açık yapılara gidiş olduğu anlaşılmıştır. Açık yapıların aksine, kapalı yapılarla başlatılan DnaK392 simülasyonlarının hiçbir tanesinde açılma eğilimi olmamıştır. Bu simulasyon dataları dikkate alındığında açık ve kapalı yapılar arasında bulunan enerji bariyerinin 194pr için en yüksek 2dep içinse en düşük değere sahip olduğu çıkarımı yapılabilmektedir. Standart MD simülasyonları örneklem konusunda yeterli olamayabilmektedir. Açık ve kapalı başlangıç geometrileriyle başlatılan simülasyonların bulunma miktarlarını kıyaslamak, bune ek olarak da MD simülasyonlarının örneklem problemini aşmak amacıyla, her protonasyon hali için geliştirilmiş örneklem elde etmeyi sağlayan bir simülasyon tekniği olan sıcaklık replika değişim simülasyonları uygulanmıştır (T-REMD). MD simülasyonlarında seçilen 4 protonasyon haline ek olarak, H226 amino asit kalıntısının yan zincirinin epsilon azot atomuna bağlı hidrojenini silmek suretiyle, D194'ün protonlu H226'nın epsilon pozisyonunda protonsuz olduğu (194prHID226) ve D201'in protonlu H226'nın epsilon pozisyonunda protonsuz olduğu (201prHID226) fazladan 2 tane protonasyon hali için de T-REMD simülasyonları uygulanmıştır. Bunun dışında, bağlacın kapalılığı teşvik edip etmediğini gözlemek için 6 tane halihazırda elde edilmiş 392 amino asit kalıntısını içeren yapılara ek, 6 tane de bağlaç bölgesinin son 4 amino asit kalıntısı olan hidrofobik 388 VLLL 392 sekansının çıkarıldığı 388 amino asit kalıntısı içeren yapılar 392'li olanlardan alınarak hazırlanmıştır. Toplam olarak 6 tane 1-392 numaralı amino asitleri içeren 6 tane de 1-388 numaralı amino asitleri ihtiva eden 12 tane T-REMD simülasyonu yapılmıştır. Her bir simulasyonun süresi 300ns olarak ayarlanmıştır. T-REMD simülasyonlarının sonuçları değerlendirildiğinde göze çarpan en önemli nokta açıklık-kapalılık dengesinin bariz bir şekilde kapalı yönünde olduğudur. Açık konformasyonların total konformasyonal uzayda oranı hesaplandığında en açık olan protonasyon hali 194pr388'de bile bu oranın %25 civarında olduğu saptanmıştır. Öte yandan, kapalılığın çok daha dominant olduğu protonasyon hallerinde çok çok daha düşük açık oranları olduğu görülmüştür. Örneğin, D201 amino asit kalıntısının protonlu olup D194 amino asit kalıntısının protonsuz olduğu durumlarda (201pr'li yapılar), açık yapılarının oranın %2-3 seviyelerine kadar düştüğü görülmüştür. D194'ün protonlu olduğu yapıların dataları incelendiğinde, bağlaç bölgesinin var olup olmamasının veya H226 amino asit kalıntısının prontonlu veya protonsuz olmasının etkisinden bağımsız olarak D194'ün proton içerdiği tüm yapıların açık oranlarının en çok olduğu senaryolar olduğu bariz bir şekilde gözlenmiştir. Bağlaç bölgesinin olduğu veya atıldığı, H226'nın protonlu/protonsuz olduğu 12 simulasyonun tümü dikkate alındığında açık ara açıklığı en çok teşvik eden durumun 194pr388, yani D194 ve H226'nın ikisinin birlikte protonlu halde durum olduğu ortaya konmuştur. Ek olarak, 194'ün protone olduğu yapılarda terminal bağlaç kalıntılarının kapalılığın tetiklenmesi üzerindeki etkisi sadece H226'nın protone olduğu durumlarda görülmüştür. Bu 2 yapı, 194pr392 ve 194pr388 kıyaslandığında, bağlaç bölgesinin kapalılığı %7 civarında arttırdığı farkedilmiştir. 194pr'nin tam zıttı olarak, bağlaç bölgesinin var olup olmamasının veya H226 amino asit kalıntısının prontonlu ya da protonsuz olmasının etkisinden bağımsız, D201 amino asit kalıntısının protonlu olduğu durumların kapalılığın en çok teşvik edildiği yapılar olduğunun altı çizilmiştir. Bu protonlanma halindeki yapılar incelendiğinde açıklık oranının hiçbir şekilde %5'i aşmadığı ve bu oranın daha bile düştüğü durumlar olduğu gözlemlendi. 194pr'nin aksine, 201pr'de bağlaç bölgesinin açıklık-kapalılık dengesine dikkate değer bir müdahalesinin olmadığı sonucuna varılmıştır. Benzer bir şekilde, H226 amino asit kalıntısının prontonlu veya protonsuz olmasının da açıklık-kapalılık dengesine bir etkisi olmadığı anlaşılmıştır. 2dep için T-REMD sonuçları analiz edilip bakıldığında 2dep392'nin açık başlangıç konformasyonuna MD simülasyon sonuçlarıyla tutarlı olarak, kapalılığa doğru bir yönelim içinde olduğu gözlemlenmiştir. Gerçekten de 201pr'den sonra kapalı konformasyonların fraksiyonu en çok 2dep'li yapılardadır. Bağlaç kısmının kapalılığı indüklemesi bariz bir durumda olmayıp sadece minör bir etki sağlamış ve bu etki temelde son 200ns'de gerçekleşmiştir. Hem D194 hem de 201 beraber protonlu olduğunda ise, 194pr'ye kıyasla daha az; 201pr ve 2dep' e nazaran da daha çok sayıda açık konformasyon görülmüştür. Bu çalışmanın yürütülmesinin diğer bir amacı da DnaK ATPaz alanının pH değişimine bağlı davranışını detaylı bir biçimde ele almaktır. ATPaz alanında yer alan nükleotit bağlanma cebini içeren aktif bölgede pek çok yüklü amino asit kalıntıları yer almaktadır. Bundan ötürü, Hsp70 proteinlerinin ortamın pH değerlerindeki dalgalanma ve değişikliklere karşı duyarlı olması beklenir. Bildiğimiz kadarıyla, literatürde 2000'lerin başında izole edilmiş DnaK NBD üzerinde yapılan iki deneysel çalışma dışında pH'a bağlı Hsp70 aktivitesini irdeleyen başka çalışmalar yer almamaktadır. Öte yandan, ne tam uzunlukta SBD-NBD içeren ne de izole NBD yapısı üzerinde pH değişimine bağlı dinamik ve aktivite regülasyonu hesaplamalı yöntemlerle aydınlatılabilmiştir. Bu sebepten ötürü, aktif bölgede yer alan hangi amino asit kalıntısının veya kalıntılarının fizyolojik pH koşullarında protonlu veya protonsuz olacağı konusu net olarak bilinmemektedir. Bu gizemi çözebilmek için ileri düzey serbest enerji hesaplama yöntemi olan termodinamik integrasyon yöntemine başvuruldu. TI simülasyonları daha önce bahsedilen 12 protonasyon hali için de yapılmıştır. Çeşitliliği sağlamak amacıyla her bir protonasyon hali için 1'er açık yapı ve 2'şer tane kapalı yapı seçilmiştir. Yapıları seçmek için, T-REMD simülasyon yörüngeleri üzerinde kümelendirme analizleri yapılarak dominant kümelerin temsili yapıları seçilmiştir. Bunlara ek olarak, E171 amino asit kalıntısının yan zinciri ve H226 amino asit kalıntısının epsilon pozisyonundaki pKa değerleri D194 ve D201 amino asit kalıntılarının farklı protonasyon hallerinde hesaplanmıştır. H226 amino asit kalıntısının epsilon pozisyonundaki pKa değerleri dikkate alındığında, pKa değerlerinin farklı senaryolarda birbirine çok yakın hatta hemen hemen aynı olarak 9 civarında hesaplanmıştır. Burdan da ne aktif bölgedeki aspartik asit ve glutamik asit amino asit kalıntılarının ne de bağlaç bölgesinin içerdiği son 4 amino asit kalıntısının sağladığı uzunluğun H226 amino asit kalıntısının epsilon pozisyonundaki pKa değerine bir etkisi olduğu sonucuna varılmıştır. Bunun dışında, E171 amino asit kalıntısının pKa değerleri incelendiğinde, E171'in protonlanma halinin D194 ve D201 amino asit kalıntılarının farklı protonlanma hallerine bağlı olmasının yüksek bir ihtimal olduğu çıkarımı yapılmıştır. Bunun aksi olarak, D194, D201, and H226 amino asit kalıntılarının pKa değerleri hesaplandığında, herbirinin fizyolojik koşullarda protonlanmış durumda olmaları gerektiği sonucuna varılmıştır. Bunun neticesi olarak, hesapladığımız pK değerleri göz önüne alındığında, dominant yük durumu olarak +12 yük durumuna ulaştığımızı ve +13 veya +14 yük durumlarınının yakalanamadığı görülmüştür. Özetlemek gerekirse, bütün atom MD simülasyonlarıyla gelişmiş örnekleme simülasyonu olan iki farklı REMD methodunu ve serbest enerji hesaplayan TI simülasyonlarını kombinasyon oluşturarak şu sorulara cevaplar bulunmaya çalışıldı: 1) Protonasyon halinin NBD'nin açık-kapalı bulunma yüzdesine ve konformasyonel dinamiğine etkisi olup olmadığı. 2) Açık-kapalı konformasyolarının oranına bağlaç bölgesinin bir katkısının olup olmadığı. 3) Kritik amino asit kalıntılarının protonasyon/deprotonasyonları üzerinden NBD'nin pH koşullarından etkilenip etkilenmediği. 4) Bağlaç bölgesinin aktif bölgedeki bir ya da birkaç amino asit kalıntısının pKa'sını arttırıp arttırmadığı. Sonuç olarak bu çalışma sonunda şu noktalar çıkarıldı. İlk olarak, DnaK NBD'nin dinamiğinin protonasyona bağlı olarak değiştiği. İlginç olan nokta ise aktif bölgedeki komşu 2 aspartatın açıklık-kapalılık noktasında zıt etkiler göstermesi oldu. D194 proteini açıklık oranını arttırma eğilimindeyken, D201 bu oranı azaltıp NBD'nin kapalılığını teşvik etmektedir. Bunun yanı sıra, farklı yük durumlarında, birden fazla sayıda birbirleriyle kimyasal denge bulunan protonasyon hallerinin olduğu görüldü. Bağlaca gelindiğinde ise bağlacın ne proteinin açılma kapanmasında ne de aktif bölgedeki aday kalıntılardan bir veya birkaçının pKa'sını arttırarak pH bağlılığında etkisi olduğu gözlemlendi.
Özet (Çeviri)
70 kDa heat shock proteins (Hsp70) are a ubiquitious and well-conserved protein family with chaperone functions. They supervise protein folding process and assist in proper protein folding and renaturation by preventing partially folded or misfolded proteins from forming amorphous aggregates and amyloid fibrils. In terms of structure, Hsp70s are composed of approximately 45 kDa N-terminal nucleotide binding domain (NBD) with ATPase activity, 25 kDa C-terminal Substrate Binding Domain (SBD) with substrate peptide binding pocket. Also, there is a conserved hydrophobic linker segment connecting the 2 domains. Hsp70 proteins do not work alone. Rather, they need aid of some other proteins called“cochaperones”to work optimally. The two auxillary cochaperones required by the Hsp70s are the 40 kDa Hsp40s(J domain proteins) and nucleotide exchange factors (NEFs). Together with the cochaperones, Hsp70 proteins form 3-membered Hsp70 chaperone machinery. For Hsp70 chaperone system to carry out all of its functions, the NBD and SBD domains must communicate with each other during the functional cycle. This mutual signal transfer and crosstalk between the domains is an intricate example of“allosteric regulation”. Basically, nucleotide status of the NBD exerts an effect on substrate affinity. Reciprocally, binding of a substrate protein to the SBD stimulates ATPase activity of the NBD. In ATP bound state of the NBD, the two domains are in docked conformation. On the other hand, in ADP bound or nucleotide free state of the NBD, these two domains are undocked and become independent of each other. In this undocked conformation, the two domains are connected to each other with the hydrophobic linker. The ATP-bound state of the NBD with docked NBD-SBD conformation binds and releases substrates at much higher rates than nucleotide free or ADP-bound state; thus, ATP-bound state of the Hsp70 is known as“low-affinity state”state with substrate binding pocket open. In contrast, when the NBD lacks any nucleotide or is bound by ADP, rate of substrate binding and release occur at way slower rates. This state of the Hsp70 proteins is called as“high-affinity state”with closed substrate binding pocket. Hence, Hsp70s shuttle between open and closed states. The hydrophobic linker is an undispensable component of the Hsp70 chaperone system. By functioning as a dynamic signal switch, the linker conveys messages in either direction, from NBD to SBD and from SBD to NBD, keeping both domains in touch. In literature, the linker, particularly the hydrophobic 388 VLLL 392 sequence, have been demostrated to be vital for both interdomain communication and dynamics of the ATPase domain. Likewise, there are many residues of the NBD playing key roles in the Hsp70 cycle, particularly in the mechanism of ATP hydrolysis. Especially, D8, K70, E171, D194, T199, and D201 residues of E.coli Hsp70 homolog DnaK and correspondants of these residues in other Hsp70 homologs have been given attention. In this study it was aimed to elucidate the conformational dynamics of the nucleotide binding ATPase domain (NBD) of E.coli DnaK in nucleotide free state by means of computational simulation techniques. First of all, so as to understand if protonation states of critical residues of interest have any effect on the opening-closure dynamics of the NBD in nucleotide free state, initially open and closed structures with different protonation states were prepared. By changing the protonation states of residues D194, D201, and H226 in distinct combinations, charge states +12, +13, and +14 were attained. Four protonation states, namely D194 protonated (194pr), D201 protonated (201pr), both D194 and D201 protonated (2pr), and both D194 and D201 unprotonated (2dep) were tested for both initially open and initially closed conformations. In each case, another residue of interest H226 was taken in protonated form. To broaden conformational space scanned and explore contribution of linker position to the dynamics of the NBD, positions of the linker were changed manually multiple times for each protonation state. According to our standard molecular dynamics (MD) simulation results (each 500 ns) of DnaK 1-392 construct of initially open conformations with these 4 protonation states, it was seen that protonation state can dramatically influence the tendency of initially open conformation towards closure. The cases in which D194 were unprotonated (2dep and 201pr) exhibited a tendency to close. Especially, 2dep became totally closed after 200 ns simulation period. On the other hand, 194pr had no tendency towards closure at all. On the other hand, all of the initially closed conformations for each of the 4 protonation states of the DnaK 1-392 retained their closed forms. Based on these simulation results, it can be deduced that the energy barrier between open and closed conformations was highest for 194pr and lowest for 2dep. In order to both decide on relative abundance of open - closed structures and circumvent sampling problems encountered during classical MD simulations, we carried out temperature replica exchange molecular dynamics (T-REMD) simulations for each protonation state. In addition to the 4 protonation states with protonated H226 residue investigated during MD simulations, 2 additional states, namely D194 protonated-H226 deprotonated (194prHID226) and D201 protonated-H226 deprotonated (201prHID226), were prepared by only removing the epsilon H atom of H226 from 194pr and 201pr cases, respectively. To elucidate whether the linker favors closed conformations, apart from these 6 different protonation cases with residues 1-392 of NBD, 6 further constructs were prepared by stripping the last 4 residues 389VLLL392 of the linker away from each of 1-392 construct. In total, 12 T-REMD simulations, 6 with 1-392 and 6 with 1-388 residues, and each with 300 ns-long were performed. Based on our T-REMD results, the most essential point to be understood is that closed conformations are much more favorable compared to open ones. Considering the ratios of open conformations, even the highest fractions of open conformations obtained in the case of 194pr388 did not exceed 25%. Looking at other cases, the percentage of open conformations can be as low as 2-3% for 201pr cases. If we look at 194pr cases, irrespective of the presence of last 4 residues of linker and protonation state of H226, open structures are most abundant in the cases of 194pr. Among 194pr and thereby all other protonation states-structures, 194pr388 (226 protonated) promotes, by far, the open structures most. Additionally, the role of the length of linker in favoring closed structures over open ones becomes more prominent when H226 is protonated with nearly 7% higher closed frames in 194pr392 than 194pr388. As opposed to 194pr, regardless of linker or protonation state of H226, 201pr cases are out and away the protonation states that exhibit lowest tendency towards opening with fraction of open structures no more than 5%. Unlike 194pr, there is no evident impact of linker on opening-closure behavior. Protonation state of H226 seemed not that important in either protonation state. In agreement with the standard MD simulations, 2dep was monitored to tend to have high number of closed frames. Indeed, 2dep comes after 201pr in terms of closed structure fractions. The contribution of the linker to the closure of the NBD was minor and seen only the last 200ns. As to 2pr states, the 2nd highest fraction of open frames, both in the presence and absence of 4 terminal residues of the linker, after 194pr were obtained. Another point of interest in this study was to scrutinize the pH dependence of DnaK ATPase domain. The active site of the ATPase domain comprises multiple charged amino acid residues; therefore, it can be expected from Hsp70 proteins to be susceptible to changes in pH conditions. To the best of our knowledge, only two experimental studies in early 2000's underlining pH dependent behavior of isolated DnaK NBD have been conducted thus far. On the other hand, no computational study has paid attention to change in the dynamics and activity of either full-length protein or NBD alone with respect to pH. Hence, which of the candidate residues in the active site are in protonated or deprotonated form around physiological pH remained elusive. To solve this mystery, thermodynamic integration (TI) simulations were performed, again for both DnaK 1-392 and DnaK 1-388. For TI simulations, for each of 12 protonation states used in the T-REMD, 2 initially closed structures alongside one open structure were picked from cluster analysis performed on the T-REMD trajectories. Additionally, pKa values of E171 and epsilon position of H226 were calculated in various protonation/deprotonation scenarios of D194 and D201. Regarding pKa values of epsilon H226, we inferred that pKa values were more or less the same around 9, indicating the fact that neither protonation states of active site aspartate and glutamate residues nor the lenght of the linker altered pKa values of H226. Protonation state of E171 is likely to depend on the protonation states of D194 and D201. When these aspartates were both deprotonated, E171 was protonated. D194, D201, and H226, on the other hand, must be in protonated states around physiological pH conditions. Consequently, according to our pKa values, we got +12 charge state, not +13 or +14. All in all, combining all atom MD simulations with REMD simulations and free energy TI simulations, the following questions were tried to be clarified in this thesis study: 1) Effect of protonation state on opening-closure abundance and dynamics of NBD 2)Whether the linker induces a change in the ratio of open to closed conformations. 3) pH dependence of the NBD through demonstration of the possible protonation/deprotonation status of critical residues 4) Whether linker promotes change in pKa of any of critical active site residues. At the end, we came to these conclusions. Dynamics of the DnaK NBD opening-closure were protonation state dependent. Intriguingly, protonation of 2 active site aspartate residues have opposite effect in such a way that protonation of D194 increases the abundance of open conformations, whereas D201 promotes more closed form of the NBD. In addition, at different charge states, there must be multiple protonation states in equilibrium. Regarding the linker, there was no direct indication of the linker being involved in opening/closure or pH dependence of the isolated DnaK NBD. Likewise, no apparent role of the linker in shifting the pKa of any critical residue in the active site.
Benzer Tezler
- Investigation of structural and functional properties of the betaine transporter BetP from Corynebacterium glutamicum by using infrared spectroscopy
Başlık çevirisi yok
GÜNNUR GÜLER
Doktora
İngilizce
2013
Fizik ve Fizik MühendisliğiJohann-Wolfgang-Goethe-UniversitätPROF. DR. WERNER MANTELE
- Computational investigation of organic reactions via mechanistic approaches
Organik tepkimelerin mekanistik yaklaşımlar kullanılarak hesapsal incelenmesi
ESRA BOZ
- Spectroscopic and kinetic investigation of the catalytic mechanism of tyrosine hydroxylase
Başlık çevirisi yok
BEKİR ENGİN ESER
- Rational design and applications of advanced functional polymer gels
İleri fonksiyonel polimer jellerin rasyonel tasarımı ve uygulamaları
MERTCAN ER
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
Kimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NERMİN ORAKDÖĞEN
- Fomitopsis officinalis, phellinus igniarius ve lactarius deliciosus mantarlarının su ekstraktlarının caernorhabditis elegans' ta yaşam uzunluğu ve stres direncine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of water extracts of fomitopsis officinalis, phellinus igniarius and lactarius deliciosus on long lasting and stress resistance in caernorhabditis elegans
AYŞE ACAR
