Klinik örneklerden izole edilen çoğul dirençli klebsiella pneumoniae izolatlarında CRISPR-CAS sistemi ile gen düzenlemesinin yapılması
Gene editing with CRISPR-CAS system in multidrug resistant klebsiella pneumoniae isolates isolated from clinical specimens
- Tez No: 776179
- Danışmanlar: PROF. DR. ZERRİN AKTAŞ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji, Mikrobiyoloji, Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: CRISPR, Genetik, Genetik mühendisliği, Genler, Karbapenemler, Klebsiella pneumoniae, CRISPR, Genetics, Genetic engineering, Genes, Carbapenems, Klebsiella pneumoniae
- Yıl: 2022
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Bakteriyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu çalışmada İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda klinik örneklerden izole edilen çoğul dirençli Klebsiella pneumoniae izolatlarında gen düzenlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya Haziran-Eylül 2020 tarihleri arasında izole edilen beş tane çoğul dirençli K. pneumoniae izolatı dahil edilmiştir. Bu izolatlarda imipenem, meroperem ve ertapenem için minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerleri, EUCAST önerilerine göre sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle saptanmıştır. Klasik polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiyle izolatların blaOXA-48, blaNDM-1 ve blaCTX-M-15 genlerinin varlığı araştırılmıştır. CRISPR-Cas sisteminde kullanılmak üzere ikili plazmid ( CRISPR-Cas9 ve CRISPR destekli sitidin deaminaz) tasarlanmıştır. Transformasyonda plazmidlerin seçiliminde kullanılacak antibiyotiklerin izolatlara duyarlılıkları araştırılmıştır. Ana vektörü oluşturmak için K. pneumoniae plazmitlerinden (pCasKP-apr, pCasKP-hph, pSGKP-km, pSGKP-spe, pBECKP-km, pBECKP-spe) hedeflenen gen bölgeleri (AmpR (Pro), AraBAD, ApmR, Cas9 ve Cas9 (D10A)-APOBEC1) PCR yöntemi ile çoğaltılmıştır. Klonlama, ligasyon ve TEDA (T5 ekzonükleaz DNA ekleme) yöntemi ile yapılmıştır. İzolatların MİK değerleri imipenem için 4-128 µg/mL, meropenem için 8-64 µg/mL ve ertapenem için 8-256 µg/mL aralığında saptanmıştır. İzolatların tümü ertapeneme, meropeneme ve imipeneme dirençli bulunmuştur. İzolatlarının tamamında (n=5) blaOXA-48 benzeri ve blaCTX-M-15 genleri, bir izolatta (%20) blaNDM-1 geni saptanmıştır. Her bir direnç geninin dizi analizi sonuçlarına göre ayrı ayrı gRNA dizileri oluşturulmuştur. İzolatlar, transformasyon aşamasında kullanılacak antibiyotiklerden yalnızca apramisine (50 µg/mL) duyarlı bulunmuştur. CRISPR-Cas sisteminde kullanılmak üzere tasarlanan ana vektöre Cas9 ve APOBEC bölgeleri klonlanamamış ancak pSGKP-AmpR (Pro)-AprR plazmiti başarılı bir şekilde oluşturulmuştur. Sonuç olarak, antibiyotiklere çoğul dirençli K. pneumoniae izolatlarında CRISPR-Cas sisteminin kullanılarak gen düzenlemesinin yapılabileceği, bu çalışmanın ülkemizden yapılan ilk çalışma olduğu, daha fazla ve ileri çalışmalar ile desteklenerek, dirençli bakterilerde antibiyotik tedavilerine alternatif bir çözüm olabileceği öngörülmektedir.
Özet (Çeviri)
In this study, it was aimed to edit the gene in multidrug resistant Klebsiella pneumoniae isolates isolated from clinical samples at Department of Clinical Microbiology, Istanbul Faculty of Medicine, Istanbul University. Five multidrug resistant K. pneumoniae strains isolated between June and September 2020 were included in the study. The minimum inhibitory concentration (MIC) values for imipenem, meroperem and ertapenem in these isolates were determined by broth microdilution method according to EUCAST recommendations. The presence of blaOXA-48, blaNDM-1 and blaCTX-M-15 genes of isolates was investigated by classical polymerase chain reaction (PCR) method. A dual plasmid (CRISPR-Cas9 and CRISPR-assisted cytidine deaminase) was designed in the CRISPR-Cas system. The susceptibility of the antibiotics to be used in the selection of plasmids for transformation to the isolates was investigated. Targeted gene regions (AmpR (Pro), AraBAD, ApmR, Cas9 and Cas9 (D10A)-APOBEC1) was amplified by PCR method. Cloning was done by ligation and TEDA (T5 exonuclease DNA assembly) method. The MIC values of the isolates between 4-128 µg/mL for imipenem, 8-64 µg/mL for meropenem, and 8-256 µg/mL for ertapenem. All isolates were resistant to ertapenem, meropenem and imipenem. The blaOXA-48-like and blaCTX-M-15 genes were detected in all isolates (n=5), and blaNDM-1 gene was detected in one isolate (20%). According to the results of the sequence analysis of the gene regions, gRNA sequences were created. It was found sensitive only to apramycin (50 µg/mL) among the antibiotics to be used in selection in transformation. Cas9 and APOBEC regions could not be cloned into the backbone vector designed for use in the CRISPR-Cas system, but the pSGKP-AmpR(Pro)-AprR plasmid was successfully created. It is the first study in our country in which gene editing was performed with the CRISPR-Cas system in bacteria resistant to antibiotics. In conclusion, it is predicted that gene editing can be done by using the CRISPR-Cas system in K. pneumoniae isolates that are multidrug resistant to antibiotics, this is the first study in our country, and it can be an alternative solution to antibiotic treatments in resistant bacteria, supported by more and further studies.
Benzer Tezler
- Doğuştan kalça çıkıklı hastalarda kalça patolojilerinin bilgisayarlı tomografi ile değerlendirilmesi
Başlık çevirisi yok
NECDET ŞÜKRÜ ALTUN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1987
Ortopedi ve TravmatolojiGazi ÜniversitesiOrtopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. ORHAN ASLANOĞLU
- Türkiye'de serebral hareket bozukluklarının etiyolojisi epidemiyolojisi ve bazı klinik özellikleri
Başlık çevirisi yok
AŞER BENSUSAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1986
Çocuk Sağlığı ve Hastalıklarıİstanbul ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
- Pre-eklampsi ve eklampsi vakalarında immünoglobülin düzeylerinin değerlendirilmesi (Klinik ve immünobiolojik araştırma)
Examination des valeurs d'immunoglobulines en cas de la toxemie gravidique
M. MURAT SEMİZ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1987
Kadın Hastalıkları ve DoğumGazi ÜniversitesiKadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MÜLAZIM YILDIRIM
- Çocuklarda akut stres hiperglisemisinde hormonal değişikliklerin ve kısa süreli prognozun incelenmesi
Başlık çevirisi yok
AYGÜN DİNDAR
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1987
Çocuk Sağlığı ve Hastalıklarıİstanbul ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Hemşireliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HÜLYA GÜNÖZ