Computational investigation of reaction mechanism of FET3 protein in yeast
Mayadaki FET3 proteininin reaksiyon mekanizmasının hesapsal olarak incelenmesi
- Tez No: 785917
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ BÜLENT BALTA
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyoloji, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 81
Özet
Bir maya türü olan Saccharomyces cerevisiae'da hücre içine demir alınımı İndirgeyici Demir Alımı Modeli'yle gerçekleşmektedir. Ferrik şelatlar (Fe3C-L), hücre yüzeyi redüktazları olan Fre1p ve Fre2p tarafından Fe+3 den Fe+2'ye indirgenerek hücre yüzeyinde şelattan ayrıştırılır. Spesifik olmayan bir indirgeme adımını spesifik bir geçirgenlik/permasyon adımı takip eder. Bu reaksiyon zinciri hücrelerin farklı ferrik şelatları demir kaynağı olarak kullanılmasını mümkün kılar. Oluşan serbest Fe+2 iyonları yüksek afiniteli bir oksidaz-permeaz kompleksi olan Fet3p-Ftr1p tarafından veya bir diğer metal taşıyıcı olan Fet4 tarafından alınır. Bu çalışmada reaksiyon mekanizmasını incelediğimiz ve indirgeyici demir alımında büyük bir role sahip Fet3p, membran-bağlı bir protein olup multicopper oksidaz protein ailesinin bir üyesidir, yüksek afiniteli demir alımını metabolize eder ve demir permeaz Ftr1p ile birlikte demir alımında rol oynar. Ftr1p yalnızca yükseltgenmiş demir formunu taşıyabildiğinden dolayı Fe+2 hücreye girmeden önce yükseltgenmelidir. Fet3p'nin demiri yükseltgeme reaksiyonu 4 adet Fe+2 iyonunu teker teker yükseltgenmesi ve bununla birlikte gerçekleşen 4 proton alınımıyla O2 molekülünün H2O'ya indirgenmesiyle gerçekleşir. Yükseltgenen demir Fet3p'deki demir bağlanma bölgesinden ayrılarak Ftr1'e geçer. Burada demir iyonları bir permeaz olan Ftr1 tarafından sitoplazmaya taşınır. Permeasyon olarak ifade edilen bu adım oldukça spesifiktir. Fet3p'nin mekanizmasının anlaşılması lakkazlar ve human ceruloplasmin gibi diğer multicopper oksidaz üyelerine ışık tutmak ve endüstriyel uygulamaları geniş olan bu ailenin mekanizmalarını anlamak için büyük bir öneme sahiptir. Fet3p, reaksiyonun gerçekleştiği aktif bölge yapısı incelendiğinde kofaktör olarak 4 bakır içerdiği görülmektedir. Bu bakırlar, Tip 1 (T1), Tip 2 (T2) ve binuclear Tip 3 (T3a ve T3b) olmak üzere özelliklerine göre 3 tipe ayrılır. T2 ve T3 bakırları, trinuclear cluster (TNC) yapısını oluşturur. Fet3p'nin kristal yapılarının hiçbirinde demir gözlenmemektedir. Ancak mutasyon çalışmalarından elde edilen bilgiler kullanılarak ve başta Bakır effluks oksidaz (CueO) olmak üzere diğer MCO'ların kristal yapıları ile karşılaştırılarak, Fet3p'nin demir bağlama bölgesinde yer alan amino asitler ve demirin yeri belirlendi. Reaksiyon sırasında H2O'ya indirgenen O2 molekülü solvent kanalından girer ve TNC'ye bağlanır. O-O bağı, koordine olduğu iki bakırdan (T1 ve T3 bakırlarından biri) iki elektron alarak kırılır. E487'nin T3 bakırları arasında köprü oluşturan oksijenlerden birine proton vermesiyle, bu bağ kırılması hızlandırılır. Native Intermadiate yapısına gelindiğinde, tüm bakırlar Cu+2 ya yükseltgenir ve bir O-2 ve iki OH- iyonu oluşur. Fet3p, substrat bağlanma bölgesine gelen dört Fe+2 iyonunu ayrı ayrı yükseltger. İndirgeyici substratlardan gelen elektronlar, T1 yoluyla TNC'ye aktarılır. Böylelikle ortamdan dört proton alarak O-2 ve OH- iyonlarının suya dönüşmesi sağlanır. Reaksiyonun sonunda tüm bakırlar indirgenir ve iki su molekülü TNC'den kanal yoluyla ayrılır. Böylelikle tamamen indirgenmiş yapı olan Fully Reduced ilk durum elde edilir. Literatürde, MCO'ların reaksiyon mekanizmalarının özellikle dioksijen bölünmesi ve peroksi ara yapısından Native Intermediate yapısına geçişin büyük bir kısmı araştırılmıştır. Native Intermediate'den Fully Reduced yapıya geçişte dört adet demir iyonunun oksidasyonu ile dört adet bakır iyonunun indirgenmesi, dört adet protonlanmayla birlikte iki su molekülü oluştuğu bilinmektedir. Fakat bu reaksiyonların hızlı gerçekleşmesi nedeniyle daha önce çalışılmamıştır ve deneysel olarak elektron transferi ve protonasyon sırasının takip edilmesi zorluğundan dolayı tepkime sırası bilinmemektedir. Reaksiyon şemasının incelenmesinin yanı sıra reaksiyonun gerçekleşmesinde önemli rol oynadığı düşünülen aminoasitler de bu çalışmada incelenmiş önceki bulgularla karşılaştırılmıştır. Reaksiyonun gerçekleşmesinde önemli rol oynadığı düşünülen D283'ü içeren döngünün rolü bu çalışmada incelenmiştir. D283'ün demirin substrat bağlama bölgesine bağlanmasında önemli bir rol oynadığı ve elektron transferinin (ET) D283 tarafından kolaylaştırıldığı bilinmektedir. Kristal yapıda bu döngünün aktif bölgeden uzak şekilde konumlandığı görülmekte ve demir bağlanmasından sonra kapandığı düşünülmektedir. Bu sebeple, D283'ün ET ve reaksiyon yolu üzerindeki rolünü bulmak için, D283 içeren döngünün açık ve kapalı geometrileri ayrı ayrı incelendi. Bilinmeyen bu kısmı aydınlatmak için bu çalışmada hesaplamalı yöntemler kullanmış, böylece olası reaksiyon mekanizması belirlenmeye çalışılmıştır. Böylelikle Fet3p aracılığıyla endüstriyel öneme sahip olan multicopper oksidaz üyelerinin mekanizmalarının aydınlatılması amaçlanmaktadır. Enerji hesaplamaları ve geometri optimizasyonları Kuantum Mekaniği/Moleküler Mekanik (QM/MM) yaklaşımıyla gerçekleştirildi. Kuantum mekanik (QM) hesaplamaları için bir Density Functional Theory (DFT) metodu olan M06-2X metodu kullanıldı. M06-2X'in bakır ve demir metallerini içeren Fet3p proteinin enerji hesaplamaları ve geometri optimizayonlarında en uygun metot olup olmadığının araştırılması için ayrıca B3LYP, TPSS ve M06 metotları denenmiştir. M06-2X literatürde metallerde kullanılmaması tavsiye edilmesine rağmen bu çalışmada gerekli tüm elektronik haller ve spin yoğunlukları yalnızca M06-2X ile elde edilebilmiştir. Bu sebeple sonuçlar M06-2X ile elde edilen enerjiler üzerinden yorumlanmıştır. QM/MM hesaplamaları sırasında hesaplanacak QM bölge seçimi, hesaplamaların doğru sonuçlar vermesi doğrultusunda büyük bir öneme sahiptir. En ideal QM bölge seçimi yapılırken özellikle reaksiyonun gerçekleştiği bölgeye yakın, reaksiyonu ve böylelikle elektron transferini, proton alış verişini etkileyebilecek kalıntılar tespit edildi. Bakırların ve demirin etrafında elektron akışına katkı sağlayacak aminoasitlerin yakınlığı araştırıldı ve bu doğrultuda farklı QM bölge hesaplamaları yapıldı. Hesaplama maliyeti de dikkate alınarak en ideal QM bölge seçildi. D283'ün kapalı olduğu yapıda ilk demirin oksidasyonu protonlanma olmadan meydana gelir ve protonlanmanın maliyeti yüzünden bir protonlanmaya gerek olmadığı sonucuna varılmıştır. Önce T1'e geçen elektronun TNC bölgesine ikinci demir gelmeden protonsuz yapıda geçip geçmediğine bakıldığında ürün elde edilememiştir. TNC bölgesinin proton almasıyla TNC'ye elektron geçişi kararlı bir yapı oluşturmuştur. İlk oksidasyondan sonra yükseltgenmiş Fe+3 ayrılır ve ikinci Fe+2 bağlanır. İkinci oksidasyonun protonlama olmadan gerçekleşip gerçekleşmediğine bakıldığında, henüz oksidasyon olmadan önceki yapıların optimizasyonu sırasında D94'ten kendiliğinden protonlanmanın gerçekleştiği görülmüştür. Bu sonuca bakılarak ikinci oksidasyon reaksiyonun protonlanma olmadan gerçekleşmediği sonucuna varılmıştır. İkinci demir bağlanmadan önce hiç protonlanma olmadan TNC'ye geçişi elde edilemeyen T1'deki elektronun, ikinci demir bağlandıktan sonra ve TNC-O-2'ye protonlanma gerçekleştikten sonra TNC'ye geçişi daha stabil bir yapıyı oluşturmuştur. Oksidasyon öncesi ikinci protonun gerekliliğine bakıldığında D94'den alınan protonun D94'e optimizasyon sırasında geri döndüğü görülmüştür bu yüzden 2. protonun gerekli olmadığı sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak demirden gelen elektron, boşalan T1 bakıra geçerek ikinci demirin oksidasyonu gerçekleşir. D283 açıkken endotermik gerçekleşen ikinci oksidasyon döngünün kapalı olduğu yapıda egzotermik gerçekleşmiştir. Sonuçlar döngünün önemine dikkat çekmektedir. İkinci oksidasyondan sonra Fe+2 iyonu Fe+3 ile yer değiştirir. Üçüncü demir için 2 protonlu, 3 protonlu ve 4 protonlu yapılar incelendi. Üçüncü ve dördüncü demir için, döngünün açık haldeki geometrileri incelendi. Sonuçlara göre, üçüncü oksidasyon için üç protonlanma bile yeterli değildir ve dördüncü protonlanmaya ihtiyaç duyulmaktadır. TNC-O-2 ve T3-OH-'ların çevredeki solventten üç proton alması en elverişli durumdur. D283'ü içeren döngü açık olduğunda, dördüncü demirde, TNC'nin alabileceği azami proton sayısı olan 4 proton varlığında bile tepkime endotermik olarak kalmaktadır. Son olarak çalışmadan çıkarılan bir diğer sonuç da şudur: Oksidasyon reaksiyonunda TNC-O-2 protonlanması TNC'nin negativitesini azaltır; bu nedenle, TNC'ye elektron transferi daha uygun hale halir. Bu bilgi göz önüne alınarak iki çıkarım yapmak mümkündür. Bunlardan ilki TNC'nin protonlanması, TNC'deki (T2 ve T3 bakırları) bakırların indirgenmesi için önemlidir. Çıkarımlardan diğeri ise substrattan elektronun TNC'ye gelmesi TNC-O-2 veya T3-OH- 'yi proton almaya zorlamaktadır. İkisinden birinin ya da her ikisinin katkısıyla 4 demirin yükseltgenmesi sağlanır.
Özet (Çeviri)
In Saccharomyces cerevisiae, a yeast species, iron uptake into the cell takes place with the Reducing Iron Uptake Model. Ferric chelates (Fe3C-L) are degraded on the cell surface by being reduced from Fe3+ to Fe2+ by the cell surface reductases Fre1p and Fre2p. The free reduced Fe2+ ions are taken up by Fet3p-Ftr1p, a high-affinity oxidase-permease complex, or by Fet4, another metal carrier. In this study, the reaction mechanism and the role of Fet3p in reducing iron uptake are examined. Fet3p is a membrane-bound protein and a member of the multicopper oxidase protein family. It metabolizes iron uptake with a high affinity for Fe2+ and plays a role in iron uptake together with iron-permease Ftr1p. Since Ftr1p can only transport the oxidized form of iron, Fe2+ needs to be oxidized before entering the cell. Fet3p couples the four-electron reduction of O2 to H2O with the one-electron oxidation of four Fe2+. The oxidized iron leaves the iron-binding site in Fet3p and is transferred to Ftr1p. Thus, Fe3+ ions are transported into the cytoplasm by a permease, Ftr1p. The understanding of the mechanism of Fet3p is of great importance to shed light on other multicopper oxidase members such as laccases and human ceruloplasmin, some having wide industrial applications. When the active site structure of Fet3p is examined, it has 4 copper as a cofactor in the active site. These coppers are divided into 3 types according to their characteristics: Type 1 (T1), Type 2 (T2), and binuclear Type 3 (T3a and T3b). T2 and T3 coppers form the trinuclear cluster (TNC). Iron as a substrate is not observed in any of the crystal structures of Fet3p. However, according to the information obtained from mutation studies and comparing them with the crystal structures of other MCOs, especially copper efflux oxidase (CueO), the amino acids in the iron-binding region of Fet3p and the location of iron were determined. Fet3p couples four one-electron oxidations of 4 Fe2+ as a substrate to the four-electron reduction of dioxygen to water by taking four protons from the environment. This process is mediated by oxidation-reduction reactions of copper ions as cofactors and consists of two stages. In the first stage, the O2 molecule, which will be reduced to H2O during the reaction, enters the TNC through the solvent channel and binds to the TNC. The O-O bond is cleaved by taking two electrons from two coppers (T1 and one of T3 coppers). Proton donation of E481 to one of the oxygens bridging T3 coppers facilitates this cleavage. Finally, all coppers are oxidized to Cu2+, and one O2- and two OH- ions are formed. In the second stage, the four reductions from Cu2+ to Cu+ with oxidation of four Fe2+ to Fe3+, and four protonations occur, and OH- and O2- ions are converted to two water molecules. In the literature, most of the first stage of the reaction mechanism of MCOs, especially dioxygen-cleavage and peroxy intermediate structure are known. However, the exact mechanism of the second stage, the order of electron and proton transfer reactions is not known because this part occurs fast. Due to the rapidity of these reactions, they have not been studied before and the order of the reaction is unknown due to the difficulty of following the protonation order experimentally. In addition to examining the reaction scheme, it is known that D283 plays an important role in iron binding to substrate-binding site, and electron transfer (ET) is enhanced by D283. However, in the crystal structure, the loop containing D283 is oriented away from the active site, suggesting that it closes only after the binding of Fe2+. Thus, to find out the role of D283 on ET and reaction pathways, the geometries are separately examined when the loop containing D283 is open and closed. In order to elucidate the unknown parts, computational methods were used in this present study, so the possible reaction mechanism will be determined. Thus, it is aimed to understand the mechanisms of other multicopper oxidase members through Fet3p. The calculations and geometry optimizations were carried out using the Quantum Mechanics/Molecular Mechanics QM/MM approach. The M06-2X method, a Density Functional Theory (DFT) method, was used for quantum mechanical (QM) calculations. B3LYP, TPSS, and M06 methods were also used to investigate whether M06-2X is the most suitable method for energy calculations and geometry optimizations of Fet3p containing copper and iron metals. Although M06-2X is not recommended to be used on metals in the literature, all necessary electronic states and spin densities could be obtained only with M06-2X in this study. For this reason, the results were interpreted over the energies obtained with M06-2X. The determination of the QM region to be calculated during the QM/MM calculations is of great importance for the calculations to obtain more accurate results. While choosing the most ideal QM region, residues that have the potential to affect the reaction, electron transfer, and proton exchange, especially close to the region where the reaction took place, were determined. The proximity of amino acids that will contribute to electron transfer around copper and Fe was investigated; therefore, calculations were made accordingly by choosing different QM regions. Considering the computational costs, the most ideal QM region was determined. In the structure where the loop containing D283 is closed, the first Fe2+ oxidation occurs exothermically without protonation while T1 is reduced. Protonation of OH- or O2- ions are not needed due to the cost of protonation. It is examined whether the first electron transfers from T1 to TNC before the second iron binds; nevertheless, the structure could not be obtained without protonation. With the protonation of the TNC region, electron transfer to the TNC has yielded a stable structure. After the oxidized iron leaves, the second Fe2+ binds. Meanwhile, the electron already transferred from the first iron remains in the protonated TNC. Considering the necessity of a second proton transfer before oxidation, the proton taken from D94 returns back to D94 during the optimization, thus the second proton transfer is not necessary. The electron from Fe2+ transfers to T1 copper, and oxidation of the second iron takes place. The second oxidation, which was endothermic when D283 was open, is exothermic in the structure where the loop is closed. The results draw attention to the importance of the loop containing D283. After the second oxidation, the oxidized Fe3+ is replaced with the third Fe2+. For the third iron, structures with two protons, three protons, and four protons are examined. For the third and fourth Fe2+ the geometries when the loop with D283 is open are also examined. According to the results, even three protonations are not enough for third oxidation, and a fourth protonation is needed. When the loop containing D283 is open, the oxidation of the fourth Fe2+ is endothermic even in the presence of four protons in TNC, which is the maximum number of protons TNC can take. In the oxidation reactions protonation of TNC-O2- decrease the negativity of TNC; thus, electron transfer to TNC is more favorable. The protonation of TNC is important to reduce coppers at TNC (T2 and T3 coppers) and for transferring an electron from the substrate to TNC. Similarly, the transfer of an electron from the substrate to TNC and the reduction of TNC coppers force the TNC-O2- or T3-OH- to take proton.
Benzer Tezler
- Computational investigation of organic reactions via mechanistic approaches
Organik tepkimelerin mekanistik yaklaşımlar kullanılarak hesapsal incelenmesi
ESRA BOZ
- Multiscale computational investigation of the kynurenine 3-monooxygenase catalyzed hydroxylation reaction
Kinürenin 3-monooksijenaz katalizli hidroksilasyon tepkimesinin çok boyutlu hesaplamalı kimya yöntemleriyle incelenmesi
YILMAZ ÖZKILIÇ
- NicC enziminin nikotinat üzerindeki katalitik aktivitesinin kuantum mekanik yöntemlerle incelenmesi
The investigation of the catalytic activity of NicC enzyme on nicotinate with quantum mechanical methods
NERİMAN ELA PEHLİVANOĞLU
- Experimental and computational study of selective CO oxidation over Au/Al2O3 catalyst
Au/Al2O3 katalizörü üzerinde seçimli CO oksidasyonunun deneysel ve hesaplamalı olarak incelenmesi
TUĞBA DAVRAN CANDAN
Doktora
İngilizce
2011
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RAMAZAN YILDIRIM
- Kinetic and thermodynamic aspects of reactions involving thiyl radicals: A computational approach
Tiyil radikali içeren reaksiyonların termodinamik ve kinetik özelliklerine hesapsal bir yaklaşım
VOLKAN FINDIK
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
KimyaBoğaziçi ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ŞARON ÇATAK
PROF. DR. VİKTORYA AVİYENTE
