Investigation of NFİB function and regulation of its putative target genes in human neural stem cell and SH-SY5Y neuroblastoma cell lines
İnsan sinir kök hücre ve SH-SY5Y nöroblastom hücre hatlarında NFIB işlevinin ve potansiyel hedef genlerinin regülasyonunun incelenmesi
- Tez No: 808949
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ASLI KUMBASAR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Moleküler Tıp, Biotechnology, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 168
Özet
Merkezi sinir sistemi, benzersiz özelliklere sahip çok sayıda nöron ve glia hücre popülasyonları içerir. Gelişim biyolojisi, bu hücresel çeşitliliğin altında yatan moleküler mekanizmaları ele almaktadır. Embriyo gelişimi sırasında, belirli özelliklere sahip hücre alt sınıflarının oluşumu, dokuya özgü transkripsiyon faktörleri (TF) tarafından gerçekleştirilir. TF'leri DNA'ya bağlanır, diğer proteinlerle etkileşime girer ve hedef genlerin ifadesini düzenler. Gelişmekte olan beyindeki önemli TF'lerden biri Nükleer Faktör I (NFI) ailesidir. Omurgalılarda dört üyesi (A, B, C ve X) bulunan NFI ailesinin her bir üyesinin de, alternatif kırpılma yoluyla oluşan çok sayıda izoformu vardır. NFI proteinleri, yüksek oranda korunmuş bir N-ucu DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi içerir ve homo- veya hetero-dimer oluşturarak TTGGC(N5)GCCAA konsensüs dizisine bağlanırlar. Bununla birlikte, NFI'ler daha az korunmuş bir C-ucu transkripsiyon modülasyon bölgesine sahiptirler ve bu bölge sayesinde hedef genlerin transkripsiyonel düzenlemelerinde farklılık gösterebilirler. Gelişmekte olan fare beyninde, Nfia, Nfib ve Nfix ifadeleri, birbiriyle örtüşen ancak aynı zamanda birbirlerinden farklı ekspresyon örüntüsüne sahiptir. Yetişkinde ise Nfi ifadesi nöral kök hücre nişleriyle (subventriküler zon) sınırlıdır. Nfic ifadesi ise merkezi sinir sisteminde düşük düzeylerde tespit edilmiş ve beyin gelişiminde bir rol oynamadığı düşünülmüştür. Fare nakavt çalışmaları, NFI'lerin beyin, akciğer ve iskelet kası gibi çeşitli organların gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir. Merkezi sinir sisteminde Nfia, Nfib veya Nfix genlerinin silinmesi, embriyonik beynin farklı bölgelerinde gecikmiş glia ve nöron farklılaşmasına, anormal hücre göçüne ve projenitör hücre proliferasyonunun artmasına yol açar. Bu üç NFI geninin de aynı hücrelerde ifade edilmesine rağmen, bir üyenin kaybı diğerleri tarafından telafi edilememektedir. İlginç bir şekilde, NFIA, NFIB veya NFIX haplo-yetersizliği olan hastalar, Nfi nakavt farelerde tespit edilen nörogelişimsel fenotiplere benzer yapısal ve fonksiyonel beyin kusurları ve makrosefali göstermektedir. Ayrıca, bir üyenin eksikliği, belirli bir beyin bölgesinde kusurlu bir fenotip oluştururken, diğer NFI üyelerinin silinmesi aynı bölgede herhangi bir değişikliğe sebep olmayabilir. Örneğin, gelişmekte olan arka beyinde, yalnızca Nfib'nin yokluğu preserebellar çekirdek nöronlarının gelişiminde gecikme ve azalmaya yol açmaktadır. Bu da Nfib'nin arka beyin gelişiminde nöral farklılaşma ile ilişkili bir rol oynadığını düşündürmektedir. NFI TF'lerindeki ifade bozuklukları ayrıca tümör gelişimi ve ilerlemesi ile ilişkilendirilmiş, NFI'lerin hem kanser gelişimini destekleyen hem de tümör baskılayıcı zıt rolleri olduğu gösterilmiştir. Örneğin, NFIB, kolorektal kanser, melanom, mide kanseri, östrojen reseptörü-negatif meme kanseri ve küçük hücreli akciğer kanserinde onkojenik bir rol oynar ve metastazı desteklerken, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri, glioblastoma, osteosarkom ve kutanöz hücreli karsinomda ise tümör baskılayıcı bir işleve sahiptir. NFI'ler, hem hücreye özgü ve birbirlerinden farklı ifade örüntüleri hem de etkileşime girdikleri nükleer protein setlerindeki ve gelişim ve hastalıklar sırasında kromatin yapısındaki farklılıklar sayesinde, çok çeşitli işlevleri gerçekleştirebilmektedir. NFI'lerin bağlandığı ve transkripsiyonunu düzenlediği hedef genlerin araştırılması, spesifik NFI etkilerinin ve NFI işlevlerinin altında yatan düzenleyici süreçlerin anlaşılmasını sağlayacaktır. Pek çok genin promotor ve enhansır bölgelerinde NFI bağlanma motiflerinin bulunmasına rağmen, bunlardan sadece birkaçının doğrudan NFI hedef genleri olduğu doğrulanmıştır. Örneğin, NFI'ler astrosit farklılaşmasındaki glial fibril asidik protein (Gfap) ve serebellar granül nöron farklılaşmasındaki gamaaminobutirik asit reseptör alt birimi alfa (Gabra) gibi hücre farklılaşması ve olgunlaşmasında yer alan genleri aktive eder. Ayrıca, nöral kök hücrelerde NFI'ler, hairy ve split-1 (Hes1), SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (Sox9) ve enhancer of zeste homolog 2 (Ezh2) gibi kök hücrenin kendini yenilemesiyle ilişkili genleri baskılar. Öte yandan NFIB, melanom hücrelerinde EZH2'nin ekspresyonunu indükleyerek metastatik yayılmayı destekleyen büyük ölçekli kromatin değişikliklerine neden olur. Ayrıca NFI'ler, hücre döngüsü inhibitörü p21'i kodlayan sikline bağımlı kinaz inhibitörü 1'in (CDKN1A) ekspresyonunu baskılayarak tümör oluşumunu destekler. NFI'lerin çeşitli dokulardaki hedef genlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, embriyonik gelişim, gelişim bozuklukları ve kanser patolojilerinde yer alan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. NFIB'nin gelişmekte olan preserebellar çekirdek nöronlarında nörogenezi nasıl düzenlediğinin araştırılması için, E14 Nfib-/- fare preserebellar nöroepitelyumda farklılaşmış gen ifadesi incelenmiş ve NFIB aday hedef genleri belirlenmiştir. Bu genlerden, beyin gelişimi sırasında ifadeleri ve işlevleri göz önüne alınarak, ayrıntılı çalışılmak üzere Cdon (Cell adhesion molecule ) ve Fgf15 (Fibroblast growth factor 15) seçilmiştir. Bu tez çalışmasında, insan nöral kök hücrelerinde (H9 insan embriyonik kök hücrelerinden türetilen insan sinir kök hücreleri, thermo fisher scientific ) fare Fgf15'in insan ortoloğu olan FGF19'un ve CDON'un, NFIB vasıtasıyla transkripsiyonel düzenlenme mekanizmaları incelenmiştir. Nöral kök hücre kültürü sistemleri, nöral kök hücrenin kendini yenilemesinin ve farklılaşmasının altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesini sağlayan, insan nöral gelişiminin in vitro olarak çalışıldığı modellerdir. Gelişmekte olan beynin çeşitli bölümlerinde nörogenezi düzenlediği bildirilen NFI'ler, in vitro koşullarda benzer işlevlere sahip olabilirler. Bu süreçleri ve bunları oluşturan moleküler mekanizmaları in vitro sistemlerde anlamak, beynin in vivo koşullarda nasıl geliştiğini ve gelişimsel bozuklukları anlamaya yardımcı olacaktır. Bu nedenle, bu tezin ilk bölümünde, insan nöral kök hücrelerinin (iNKH) nöronal farklılaşmasında NFI işlevi ve potansiyel NFIB hedefleri CDON ve FGF19'u düzenleme mekanizmaları in vitro incelenmiştir. iNKH'leri, fibroblast growth factor 2 (FGF2) ve epidermal growth factor (EGF) varlığında kendi kendini yenileme ve büyüme faktörleri geri çekildiğinde nöronlara farklılaşma yeteneğine sahiptir. Ayrıca bu hücrelerde, orta ve arka beyin bölgelerini temsil eden gen ifadeleri tespit edilmiş, ancak ön beyin transkripsiyonel kimliğini oluşturan genlerin ekspresyonu saptanmamıştır. Kantitatif RT-PCR analizleri, büyüme faktörlerinin uzaklaştırılmasından yedi gün sonra, farklılaşmakta olan iNKH'lerinde, NFIB, NFIC ve NFIX mRNA ifadesinin azaldığını, NFIA ifadesinin ise arttığını göstermiştir. NFIA mRNA düzeyleri bu hücrelerde çok düşük olduğundan, iNKH'lerinde nöronal farklılaşma sırasında toplam NFI ifadesinin azaldığı sonucuna varılmıştır. NFIB iNKH'lerinde diğer NFI proteinlerine nazaran çok daha yüksek seviyelerde ifade edilmektedir. NFI'in kök hücre proliferasyonu ve nöron farklılaşmasındaki rolünün araştırılması amacıyla, NFIB ifadesi arttırılmış ve susturulmuş iNKH'lerinde BrdU işaretleme deneyleri ve nöral kök hücreye ve nöronlara özgü proteinlerin immünofloresan boyamaları gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, NFIB aşırı ekspresyonunun veya yıkımının, bu hücrelerde proliferasyon ve nöron oluşturma potansiyelini etkilemediği görülmüştür. NFIB ifade artırımı gerçekleştirilen deneylerde bir değişiklik gözlemlenilmemesinin sebebi, NFIB ile birlikte kofaktör olarak hareket eden başka proteinlerin eksikliği olabilir. Ek olarak, NFIB'nin bu hücrelerde yalnızca % 30-50 oranında susturulması ve analizlerin tüm hücre popülasyonunda yapılması, NFIB kaybının neden olduğu olası değişikliklerin tespit edilememesine yol açmış olabilir. Bu nedenle, bu çalışmadaki bulgular, kesin olarak NFIB'nin iNKH'lerin farklılaşması ve/veya kendi kendini yenilemesinde bir rolünün olmadığını göstermemektedir. Bu çalışmada, FGF19 iNKH'lerinde yeni bir NFIB transkripsiyon hedef geni olarak tanımlanmıştır. İnsan FGF19'u, çeşitli dokular arasında en çok fetal beyinde ifade edilmektedir. Daha önce yapılan bir çalışmada fare nöroepitel ve kortikal hücrelerine rekombinant insan FGF19 eklendiğinde, nöronal farklılaşmanın arttığı gösterilmiştir. Bu bulgularla tutarlı olarak, kantitatif RT-PCR analizleri, büyüme faktörlerinin uzaklaştırılması üzerine farklılaşan iNKH'lerinde FGF19 ifadesinin arttığını göstermiştir. Ayrıca, NFIB ifadesinin susturulduğu iNKH'lerinde FGF19 ekspresyonu artarken, NFIB ifade artırımı yapılan hücrelerde FGF19 azalmaktadır. Bu veriler, NFIB'nin iNKH'lerinde FGF19 transkripsiyonunu düzenlediğine işaret etmektedir. Ayrıca FGF19 promotorunun kontrolündeki lusiferaz aktivitesinin NFI'ler tarafından doğrudan baskılanması, FGF19'un NFI hedef geni olduğunu doğrulamıştır. Ek olarak, NFI'in FGF19 promotoru ile in vivo koşullarda etkileşimi, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deneylerinde teyit edilmiş, NFI proteinlerinin iNKH'lerinde FGF19 promotörünün transkripsiyon başlangıç noktasına göre -777/- 791 bölgesini işgal ettiği gösterilmiştir. Sonuç olarak, in vitro nöronal farklılaşma sırasında NFIB ifadesi azalırken, FGF19 artmakta, NFIB iNKH'lerinde FGF19 expresyonunu doğrudan baskılamaktadır. Gelecek çalışmalarda, iNKH'lerin kendini yenileme ve nöral farklılaşma süreçlerinde, NFIB'nin FGF19 transkripsiyonunu baskılamasının işlevsel önemi araştırılabilir. Önceki çalışmalar, immünoglobulin üst ailesine ait bir hücre yüzey glikoproteini olan Cdon ifadesinin, embriyonik Nfi nakavt fare beyninde arttığını göstermiştir. CDON, insan ve fare gelişimi sırasında başta beyin, kas ve endokrin dokular olmak üzere çeşitli dokularda ifade edilir. Ayrıca CDON'un in vitro koşullarda miyogenezi ve nörogenezi teşvik ettiği ve beyin ve iskelet kası gelişimi için gerekli olduğu gösterilmiş, çeşitli dokularda proliferasyon ve farklılaşma süreçlerinin kontrolünde rol oynadığı raporlanmıştır. Bununla birlikte, bu tez çalışmasında, CDON ifadesinin nöronal farklılaşmaya tabi tutulan iNKH'lerinde azaldığı tespit edilmiştir. Ayrıca, NFIB ifadesinin arttırıldığı veya susturulduğu iNKH'lerinde, CDON ifadesinde bir değişiklik bulunmamıştır. Bu veriler, CDON'un bu sistemde bir NFIB hedef geni olmadığını göstermektedir. Son zamanlarda CDON, SHH ligandının yokluğunda apoptozu indükleyen bir“dependence”reseptörü olarak tanımlanmıştır. Kanser gelişimi sırasında, sınırlı SHH bulunan tümörijenik dokuda, CDON'un apoptotik etkilerinin bertaraf edilmesi için ekspresyonunun baskılanması muhtemeldir. Gerçekten de, CDON ifadesinin, kolon, akciğer ve nöroblastom kanserlerinde azaldığı gösterilmiş ve CDON'a tümör baskılayıcı bir rol atfedilmiştir. NFI'ler ise çeşitli kanserlerde tümör gelişimi ve ilerlemesinde onkojenik bir rol oynamaktadır. Bu veriler ışığında, CDON transkripsiyonunun NFI'ler tarafından düzenlenip düzenlenmediği SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde incelenmeye devam edilmiştir. Kromatin immünopresipitasyon tahlilleri, iNKH'lerinde ve SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde, NFI'lerin CDON promotorunun transkripsiyon başlangıç noktasına göre -8/-22 ve - 941/-955 bölgelerine bağlandığını göstermiştir. Ayrıca, NFI'ler CDON promotoru kontrolündeki lusiferaz ekspresyonunu baskılamakta ve NFI bağlanma bölgelerinde yapılan mutasyonlar bu baskılamayı ortadan kaldırmaktadır. Böylece, bu bölgelerde in vivo koşullarda tespit edilen NFI-CDON etkileşiminin işlevsel olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, NFIB ifadesinin susturulduğu SH-SY5Y hücrelerinde CDON ekspresyonunun artması, NFIB-CDON ekseninin nöroblastom biyolojisinde rol oynadığını düşündürmüştür. Bunun akabinde, NFIB'nin SH-SY5Y hücrelerinde sağkalım ve proliferasyona etkisini incelemek üzere, NFIB ifadesi susturulmuş SH-SY5Y hücrelerinde koloni oluşumu ve MTT tahlilleri yapılmış, bu hücrelerde hücre canlılığı ve çoğalmasının ciddi oranda azaldığı tespit edilmiştir. Bu bulgular, NFIB'nin nöroblastomda onkojenik bir rol oynayabileceğini göstermektedir. İlginç olarak, son yıllarda, NFIB, SH-SY5Y dahil olmak üzere nöradrenerjik nöroblastom hücre hatlarında tümör oluşumu için gerekli ana transkripsiyon faktörleri PHOX2B, HAND2 ve GATA3 ile birlikte bir gen düzenleyici ağ içinde tanımlanmıştır, fakat NFIB'nin nöroblastomdaki rolü henüz çalışılmamıştır. NFIB'nin SH-SY5Y hücre proliferasyonunu CDON ekspresyonu üzerinden etkileyip etkilemediğini araştırmak üzere, aynı anda NFIB ve CDON ifadeleri susturulmuş SH-SY5Y hücrelerinde MTT tahlilleri ve koloni oluşturma deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ne var ki, NFIB ifadesi azaltılmış SH-SY5Y hücrelerinde artan CDON ifadesinin normal seviyelerin altına indirilmesi, gözlemlenen fenotipi geri döndürmemiştir. NFIB susturulmuş hücrelerde, apoptozu indükleyen veya proliferasyonu durduran diğer potansiyel NFIB hedef genlerin ekspresyonlarının artması sebebiyle CDON'un tek başına susturulması yeterli olmayabilir. Daha önceki çalışmalarda, NFIB'nin hücre döngüsünü durduran p21 proteinini kodlayan CDKN1A genini baskıladığı gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında da, NFIB veya NFIB ve CDON susturulması gerçekleştirilen SH-SY5Y hücrelerinde CDKN1A ekspresyonunun arttığı kantitatif RT-PCR analizi ile tespit edilmiştir. Bütün bu bulgular, NFIB'nin SH-SY5Y hücrelerindeki onkojenik rolünü, apoptozu engelleyerek ve/veya hücre döngüsü bileşenlerini düzenleyerek gerçekleştirebileceğini göstermiştir. Ayrıca NFIB, SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşmasını tetikleyebilir ve/veya nöroblastomun metastatik duruma geçmesi ve ilerlemesine katkıda bulunabilir. Ancak, bu olası durumların ve bunların altında yatan moleküler mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir. Öte yandan, gelecekteki çalışmalarda, NFIB aracılı CDON ekspresyonunun baskılanmasının fonksiyonel sonuçları başka gelişim ve hastalık modellerinde ele alınabilir.
Özet (Çeviri)
The central nervous system comprises numerous neuronal and glial subpopulations that have unique identities. Molecular mechanisms that underlie the generation of this cellular diversity have been under investigation. During development, the formation of cell subclasses with particular features is determined by tissue-specific transcription factors (TF). TFs sequence-specifically bind to DNA, interact with other proteins, and affect the expression of target genes. One of the key TFs in the developing brain is the Nuclear Factor I (NFI) family. There are four members (A, B, C, and X) in vertebrates. NFI proteins comprise a highly conserved N-terminal DNA binding and dimerization domain and bind to a TTGGC(N5)GCCAA consensus sequence as homo or heterodimers. However, they have a less conserved C-terminal transcription modulation domain which may lead to differential transcriptional regulation of target genes. In the developing mouse, Nfia, Nfib, and Nfix are expressed in an overlapping but distinct expression pattern in different regions of the embryonic brain, while their expression is restricted to stem cell niches in the adult. In the central nervous system, deletion of each member leads to delayed glial and neuronal differentiation, aberrant cell migration and increased proliferation. In the developing hindbrain, only the absence of Nfib leads to delayed development of several precerebellar nuclei, indicating that Nfib may play a unique role in this system. Dysregulated expression of NFIs have also been linked to tumor growth and progression, however, with opposing effects. For example, NFIB is oncogenic and promotes metastasis in colorectal cancer, melanoma, gastric cancer, estrogen receptor (ER)-negative breast cancer, and small cell lung cancer; while it has a tumorsuppressive function in non-small cell lung cancer, glioblastoma, osteosarcoma, and cutaneous cell carcinoma. NFIs perform their context dependent, cell-type and tissue specific functions, via regulation of specific set of downstream transcriptional targets. Despite the fact that NFI binding motifs have been found in the promoter and upstream enhancer regions of many genes, only a few of them have been so far investigated as direct NFI targets. Further identification and characterization of downstream targets of NFIs in various tissues will help elucidate molecular mechanisms that regulate embryonic development and related diseases, as well as cancer pathologies. In an attempt to investigate how NFIB regulates neurogenesis in developing precebellar nuclei, differentially expressed genes in E14 Nfib knock-out mouse precerebellar neuroepithelium have been analyzed. The RNA profiling analysis revealed putative candidates for further research. Of these putative NFIB targets, we selected Cdon (Cell adhesion molecule related, down regulated by oncogenes) and Fgf15 (Fibroblast growth factor 15), since these genes have been implicated in neural development of the cortex. We examined NFIB-mediated transcriptional regulation mechanisms of CDON and FGF19, the human ortholog of mouse Fgf15, in human neural stem cells (hNSCs derived from H9 ESC, Gibco). Neural stem cell culture systems provide an in vitro model of human neural development. Since NFIs have been reported to regulate neuron production in diverse parts of the developing brain, they may have comparable functions in vitro. Understanding these processes and the underlying molecular mechanisms in vitro will also help understand how the brain develops in vivo as well as failures in this process. Thus, in the first chapter of the thesis, we set out to examine NFI function and regulation mechanisms of potential NFIB targets, CDON and FGF19, in neuronal differentiation of hNSCs in vitro. RT-qPCR analyses revealed that mRNA expression of NFIB, NFIC, and NFIX is downregulated, whereas NFIA is upregulated in differentiating hNSCs. Since NFIA levels are quite low in these cells, overall NFI expression levels decrease during neuronal differentiation in hNSCs. These cells express NFIB at much higher levels compared to the other NFI members. Therefore, this study focuses on NFIB's role in hNSCs. We analyzed cell proliferation and differentiation by BrdU incorporation assays and immunofluorescence staining of neural stem and neuronal marker proteins. However, NFIB overexpression or knockdown did not affect the proliferation or neuronal differentiation potential of hNSCs. Nevertheless, these data cannot preclude NFIB's potential role in differentiation and/or self-renewal of hNSCs since NFIB could be silenced only by 30–50% in these cells and analyses were performed in whole cell populations that might mask possible changes induced by NFIB loss. Moreover, in NFIB overexpression experiments, we may need other proteins acting as cofactors that are not supplied along with NFIB. This study identifies FGF19 as a novel downstream target of NFIB in hNSCs. Human FGF19 is preferentially expressed in the fetal brain, among other tissues. Recombinant human FGF19 treatment has been shown to enhance neuronal differentiation in mouse neuroepithelial and cortical cells. In accordance with these data, FGF19 expression increases in differentiating hNSCs. Moreover, FGF19 expression increases in NFIB silenced hNSCs while it is reduced in NFIB overexpressing cells, indicating that NFIB regulates FGF19 transcription in hNSCs. Indeed, NFIs directly repress FGF19 promoter-driven luciferase activity, confirming that NFIs transcriptionally target FGF19. Moreover, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays showed that NFI proteins occupy −777 (relative to the transcription start site) in hNSCs, indicating NFI interaction with the FGF19 promoter in vivo. Since NFIB expression decreases upon neuronal differentiation, while FGF19 increases and NFIB directly represses FGF19 in hNSCs, future studies are required to address functional relevance of NFIBmediated FGF19 repression in the control of self-renewal and neural differentiation of these cells. In the absence of NFI, Cdon, a cell surface glycoprotein of the immunoglobulin (Ig) superfamily, is upregulated in the developing mouse brain. CDON is expressed in various tissues, primarily in the brain, muscle, and endocrine tissues during human and murine embryogenesis. Moreover, CDON is implicated in proliferation and differentiation control as it promotes myogenesis and neurogenesis in vitro and is essential for proper brain and skeletal-muscle development. However, in this study, CDON expression decreased in differentiating hNSCs and it did not change in NFIB overexpressed or silenced hNSCs, analyzed by RT-qPCR. These data indicate that CDON is not an NFIB target in this system. Recently, CDON has been described as a dependence receptor that induces apoptosis in the absence of its ligand SHH. During cancer progression, in an environment with limited SHH, tumorigenic tissue may downregulate CDON to eliminate its apoptotic activity. Indeed, CDON expression decreases in colon, lung, and neuroblastoma tumors, implicating a tumor suppressor role for CDON. As NFIs are involved in progression of various cancers, we examined whether NFIs regulate CDON transcription in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. ChIP assays showed that NFIs bind to human CDON gene regulatory regions, -8 and -941 (relative to the transcription start site), in hNSCs and SH-SY5Y cells. Moreover, NFIs repress CDON promoter-driven luciferase expression via interacting with those NFI sites. Finally, CDON is upregulated in NFIB silenced SH-SY5Y cells, suggesting that the NFIB-CDON axis may be involved in neuroblastoma biology. On the other hand, silencing NFIB in SH-SY5Y cells decreases cell viability and proliferation, suggesting an oncogenic role for NFIB in neuroblastoma. Next, we tested the hypothesis that NFIB may affect SH-SY5Y cell survival by suppressing expression and thereby, pro-apoptotic activity of CDON. However, downregulation of CDON on its own could not rescue the phenotype induced by NFIB silencing, most likely because other NFIB downstream targets, which may include p21, are also involved. Further studies are required to investigate the functional consequences of NFIB mediated CDON repression in other developmental systems and disease models. NFIB's oncogenic effects in SH-SY5Y cells may involve inhibition of apoptosis and/or regulation of cell cycle components. Moreover, NFIB might promote differentiation of SH-SY5Y cells and/or contribute to the aggressive state of neuroblastoma tumorigenesis. However, these and underlying mechanisms need to be further investigated.
Benzer Tezler
- Investigation of the interaction between NFI and its potential interaction partner BRG1
NFI proteininin potansiyel etkileşim partneri olan BRG1 ile etkileşiminin araştırılması
SELİM TÜRKEL
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of NFIB binding to CDO and FGF19 gene regulatory regions by chromatin immunoprecipitation
NFIB'nin CDO ve FGF19 gen düzenleyici bölgelerine bağlanmasının kromatin immün çöktürme yöntemiyle araştırılması
CEMRE LEKTEMUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of nuclear factor one function by forced expression of wildtype and dominant negative NFI proteins
Yaban tip ve dominant negatif NFI proteinlerinin ifade artırımı ile nükleer faktör I fonksiyonunun araştırılması
VAROL GÜLER
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- In vitro investigation of the interactions of nuclear factor one proteins with transcriptional regulators PIN1 and LMO4
Nükleer faktor ı proteinlerinin transkripsiyonel ragülatörler PIN1 ve LMO4 ile etkileşimlerinin in vitro olarak araştırılması
SİNEM SARITAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of the interactions between NFIB and potential binding partners MAD2B and ATXN3
NFIB proteininin potansiyel bağlanma partnerleri olan ATXN3 ve MAD2B ile etkileşiminin araştırılması
EDA YILMAZYILDIRIM
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR