PCR tekniği kullanımı ile DNA dizilerinde mutasyon oluşturulması (İn vitro mutagenez)
Constittution of mutations in DNA segments (In vitro mutagenesis) with the usage of PCR technique
- Tez No: 80898
- Danışmanlar: PROF.DR. MERAL ÖZGÜÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: İn-vitro mutagenez, PCR, Fenilalanin Hidroksilaz, Fenilketonüri, Transfeksiyon, In-vitro mutagenesis, PCR, Phenylalanine Hydroxylase, Phenylketonuria, Transfection
- Yıl: 1999
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 67
Özet
Bir canlının genetik şifre dizisinde meydana gelen değişikliğe mutasyon adı verilir. Bir mutasyonun patolojik bir durum ortaya çıkarması, fenotipi etkilemesiyle mümkündür. Bunun gösterilmesinin en iyi yolu mutant proteinin fonksiyon analizi çalışmasının yapılmasıdır. Bu amaçla, mutant proteini kodlayacak olan gene ait olan cDNA, bir vektör yardımı ile model bir hücre sistemine verilerek mutant proteinin ekspresyonu sağlanır. Bu mutant proteinin fonksiyonu ölçülerek fenotipi etkileyici niteliği ortaya konur. Bir enzimin incelenmesi durumunda fonksiyon analizi, mutant proteinin biyolojik aktivitesinin doğal proteinle karşılaştırılması ile yapılır. Otozomal ressesif hastalıklar, iki allellerinden birinde mutasyon taşıyan anne ve babanın çocuğuna hasta alicileri aktarmaları sonucunda lA olasılıkla görülür. Bu hastalıklardan biri olan fenilketonüri hastalığı insan karaciğerinde sentezlenen Fenilalanin Hidroksilaz enzim geninde meydanan gelen mutasyon sonucu oluşan fonksiyon kaybı ile meydana gelir. Fonksiyon analizi çalışması için, mutasyon taşıyan hasta bireylerin karaciğerlerinden örnek alarak enzim çalışması yapmak etik değildir. Bu amaçla, bu mutasyonu Fenilalanin Hidroksilaz enzim geninde oluşturmak gerekmektedir. Bu çalışmanın amacı insan Fenilalanin Hidroksilaz cDNAsı üzerinde L48S mutasyonunu PCR ile mutagenez yöntemi kullanarak oluşturmaktır. PCR tekniği ile mutagenez, uygulaması kolay, düşük maliyetli bir yöntemdir. Oluşturulan mutant cDNAnın, COS-1 memeli hücrelerine transfekte edilerek bu mutant enzimin fonksiyon analizi çalışmasında kullanılması öngörülmektedir. Çalışmada, iki aşamada oluşturulan iki mutajenik fragman birleştirilerek mutant cDNA fragmanı elde edilmiştir. Fonksiyon analizi çalışmasında kullanılmak üzere COS-1 hücre hatlarında DEAE-Dextran transfeksiyon protokolü standardize edilmiştir. DEAE-Dextran transfeksiyonu uygulaması kolay, düşük maliyetli ve özel gereç istemeyen bir metoddur. COS-1 hücrelerine pEGFP plazmidi transfekte edilerek green fluorescent protein, bildirici gen olarak eksprese edilmiş ve transfeksiyon başarı oranı %10 olarak saptanmıştır.
Özet (Çeviri)
The best way to define a phenotypic change due to a mutation is the functional analysis of the protein. For this, the mutant cDNA must be cloned into a vector and must be expressed in a model system. If the protein studied is an enzyme, the function analysis is achieved by the comparison of the mutant enzyme's activity with the wild-type protein. As an autosomal recessive disease, phenylketonuria is due to the mutations in the Phenylalanine Hydroxylase enzyme gene. It is not ethical to obtain liver biopsy samples from the mutation bearing patients for enzyme activity study. The mutant Phenylalanine Hydroxylase enzyme cDNA with the mutation of interest should be produced under in-vitro conditions. In this study the L48S mutation on the human Phenylalanine Hydroxylase cDNA is produced with the use of the PCR technique. In-vitro mutagenesis using PCR is an easy to perform, low-cost technique. The mutant cDNA produced is transfected to COS-1 cell lines to perform function analysis. The two mutagenic fragments produced over the wild-type cDNA by the use of mutagenic primers are united by a second reaction for a full length mutated fragment. The DEAE-Dextran transfection protocol is standardized for transfection of COS-1 cells to be used in the enzyme activity study. This is an easy-to-use, low cost method for the transfection of eucaryotic cell lines. The pEGF plasmid is transfected into COS-1 cells by DEAE-Dextran method and the green fluorescent protein is expressed as a reporter gene. The transfection efficiency is calculated as 10%.
Benzer Tezler
- Identification of the lactobacillus species originated from human gut by pcr - ardra technique
İnsan bağırsağı kaynaklı lactobacıllus türlerinin pcr-ardra tekniği ile tanımlanması
FATMA MERVE METERELLİYOZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
BiyolojiAbant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Bölümü
YRD. DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- DNA dizilerinin tayinine yönelik uygulama seti (kit) tipinde elektrokimyasal nanobiyosensörlerin tasarımı
Design of electrochemical nanobiosensors in the application kit type for the determination of DNA sequences
HASRET SUBAK
- Role of DNA topoisomerase IIβ in osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
İnsan mezenkimal kök hücrelerinin osteogenik farklılaşmasında DNA topoizomeraz IIβ'nın rolü
AYSEL KARAGÖZ
Doktora
İngilizce
2017
Genetikİstanbul ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
- Antifungal peptid tasarimi ve rekombinant olarak üretimi
Antifungal peptide design and recombinant production
DİLARA HERDEM
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiErciyes ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZÜLAL KESMEN
- Yassı hücreli dudak karsinomu etiyopatogenezinde herpes simpleks virüs etkinliğinin real-time PCR tekniği ile araştırılması
Başlık çevirisi yok
HIZIR KILIÇARSLAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2005
Kulak Burun ve BoğazOndokuz Mayıs ÜniversitesiKulak Burun Boğaz Ana Bilim Dalı
PROF.DR. YÜCEL TANYERİ