Metisiline dirençli klinik staphylococcus aureus izolatlarında antibiyotik direncinin CRISPR/CAS9 temelli genom düzenlemesi ile baskılanması
Suppression of antibiotic resistance in methicillin-resistant clinical staphylococcus aureus (MRSA) isolates using CRİSPR-CAS9 based genome editing
- Tez No: 811134
- Danışmanlar: PROF. DR. ŞAFAK ERMERTCAN, DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Eczacılık ve Farmakoloji, Mikrobiyoloji, Pharmacy and Pharmacology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 125
Özet
Son yıllarda enfeksiyon hastalıklarının tedavisindeki potansiyel terapötik ajanların yetersiz kalması, ilaç endüstrinin yıllar içinde yeni antibiyotik üretimine birçok nedenden dolayı sıcak bakmaması artan direnç sorunuyla mücadelede antimikrobiyal etki için yeni yaklaşımları ve bu yaklaşımlara uygun yeni ilaç arayışlarını başlatmıştır. CRISPR/Cas sistemi, bakteri ve arkelerin plazmid veya faj gibi yabancı DNA'ya karşı geliştirdiği ve yabancı genomu yok etmesini sağlayan RNA temelli nükleaz kompleksidir. Antibiyotik direnciyle mücadelede yeni terapötik arayışı CRISPR/Cas antimikrobiyalleri ile ilgili yapılan araştırmaları hızlandırmıştır. Proje amacımız; CRISPR/Cas9 sistemi ile ciddi bir tehdit olan metisiline dirençli klinik Staphylococcus aureus (Methicillin Resistant S. aureus - MRSA) kökenlerindeki metisilin, gentamisin ve siprofloksasin direnç genlerini hedefleyip, bu genlerin baskılanmasını sağlayarak bakterin direnç profilinde değişiklik gerçekleştirmek ve bakterilerin antibiyotiklere duyarlı hale gelmesini sağlamaktır. Proje kapsamında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim dalı Bakteriyoloji Laboratuvarı'nda izole edilen MALDITOF-MS ile tanımlanması yapılan S. aureus kökenlerinin antibiyotik duyarlılıkları otomatize sistem olan VITEK-2 ile belirlendi. Antibiyotik duyarlılık sonuçlarına göre metisilin direnci gösterdiği belirlenen tüm kökenlerde mecA, grlA, grlB, aacA direnç genlerinin varlığı konvansiyonel PCR ile gösterildi. RW3A primeri ile REP-PCR'da klonal ilişkisi gösterilen kökenlerden seçilen temsilci bir izolatla çalışmaya devam edildi. NCBI veri tabanındaki sekans verileri göz önünde bulundurularak yukarıda belirtilen direnç genlerine yönelik sgRNA'lar tasarlandı. Hedef bölgelere özgü sgRNA'lar kompetan MRSA kökenine elektroporasyon ile aktarıldı. Plazmidi alarak kloramfenikollü TSB'de üreyen kolonilerden seçilen temsilcilerde koloni PCR gerçekleştirildi. Bu kolonilerden total RNA izolasyonu ardından cDNA sentezi gerçekleştirilerek RT-PCR ile mecA, grlA, grlB, aacA genlerinin ekpresyon oranı değişimleri incelendi. Direnç genlerinin baskılanmasına bağlı olarak disk difüzyon ve sıvı mikrodilüsyon ile direnç durumundaki değişimler gösterildi. Knock-out (KO)-mecA ve Wild type (WT) kökenden protein izolasyonu gerçekleştirilerek protein konsanstrasyonu ölçüldü ve PBP2a ekspresyonundaki değişim Western Blot yöntemiyle incelendi. KO kökenlerden genomik DNA izolasyonu gerçekleştirilerek hedef bölgeleri içine alacak şekilde 1000-1200 bp'lik alanlar PCR ile amplifiye edilerek sanger sekans dizi analizi ile konfirme edildi. VITEK-2 sonuçlarına göre 20 klinik S. aureus izolatının hepsi metisiline dirençli olarak bulundu. mecA, grlA, grlB genleri izolatların hepsinde saptanırken üç izolat haricinde aacA geni de izolatlarda konvansiyonel PCR ile gösterildi. RT-PCR sonuçlarına göre WT ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı şekilde mecA-KO kökeninde mecA gen ekspresyonunun 1.5 katlık, grlA-KO kökeninde grlA geninin 5.5 katlık, grlB-KO kökeninde grlB geninin 6 katlık, aacA-KO kökeninde aacA geninin 4 katlık azalma gösterdiği belirlendi. Fenotipik antibiyotik duyarlılık testlerindeki sonuçlar değerlendirildiğinde bakterilerdeki mecA, grlA, grlB ve aacA genlerinin baskılanması metisilin, kinolon ve aminoglikozid direncinin kırılmasını sağladı. Sonuç olarak kökenler ilgili antibiyotiklere dirençli kategorisinden duyarlı kategorisine geçti. Western blot ile PBP2a'daki değişim incelendiğinde KO kökeninde WT ile kıyaslandığında PBP2a ekspresyonunda %70 oranında azalma saptandı. Sanger sekans dizi analizine göre grlB ve aacA genlerinde nokta mutasyonları tespit edilirken, grlA ve mecA geninde 3 baz değişiminin gerçekleştiği görüldü. Gerçekleştirdiğimiz çalışma birçok bakteride farklı antibiyotiklere karşı direnci yok etmede CRISPR antimikrobiyallerinin kullanılabileceğini göstermesi açısından önemlidir. Çalışmamız ayrıca CRISPR antimikrobiyalleri ve direnç gelişimi nedeniyle kullanılamayan geleneksel antibiyotiklerin kombine terapide kullanımını inceleyeceğimiz çalışmalara, CRISPR-Cas içeren faj kokteylleri ve bunların nanofarmasötikler ile kombinasyonuna dair ilerleyen süreçteki çalışmalara temel oluşturacak verileri sunmaktadır. Anahtar Kelimeler; Antibiyotik direnci; Metisiline dirençli Staphylococcus aureus; CRISPR/Cas sistemi
Özet (Çeviri)
In recent years, the inadequacy of potential therapeutic agents in the treatment of infectious diseases and the fact that the pharmaceutical industry has not favoured the production of new antibiotics for many reasons over the years have initiated new approaches for antimicrobial effect in the fight against the increasing resistance problem and the search for new drugs suitable for these approaches. The CRISPR/Cas system is an RNA-based nuclease complex that bacteria and archaea develop against foreign DNA such as plasmids or phages and destroy the foreign genome. The search for new therapeutics in the fight against antibiotic resistance has accelerated the research on CRISPR/Cas antimicrobials. The aim of our project is to target methicillin, gentamicin and ciprofloxacin resistance genes in methicillin-resistant clinical Staphylococcus aureus (Methicillin Resistant S. aureus - MRSA) strains, which is a serious threat, by using CRISPR/Cas9 system and to change the resistance profile of the bacteria by suppressing these genes and to make the bacteria sensitive to antibiotics. Within the scope of the project, antibiotic susceptibilities of S. aureus strains isolated in the Bacteriology Laboratory of Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology were determined by VITEK-2, an automated system. According to the antibiotic susceptibility results, the presence of mecA, grlA, grlB, aacA resistance genes in all strains that were determined to be methicillin resistant was demonstrated by conventional PCR. The study was continued with a representative isolate selected from the strains that showed clonal relationship in REP-PCR with RW3A primer. Considering the sequence data in the NCBI database, sgRNAs were designed for the resistance genes mentioned above. Target region-specific sgRNAs were transferred to the competent MRSA strain by electroporation. Colony PCR was performed on selected representatives of colonies grown in TSA with chloramphenicol after receiving the plasmid. After total RNA isolation from these colonies, cDNA synthesis was performed and expression ratio changes of mecA, grlA, grlB, aacA genes were analysed by RT-PCR. Depending on the suppression of resistance genes, changes in resistance status were shown by disc diffusion and broth microdilution. Protein concentration was measured by protein isolation from knock-out (KO)-mecA and wild type (WT) strains and the change in PBP2a expression was analysed by Western blotting. Genomic DNA was isolated from KO strains and 1000-1200 bp areas were amplified by PCR to include target regions and confirmed by Sanger sequence analysis. According to VITEK-2 results, all 20 clinical S. aureus isolates were found to be methicillin resistant. mecA, grlA, grlB genes were detected in all isolates, while aacA gene was detected by conventional PCR in all but three isolates. According to RT-PCR results, it was determined that mecA gene expression decreased 1.5-fold in mecA-KO isolate, grlA gene decreased 5.5-fold in grlA-KO isolate, grlB gene decreased 6-fold in grlB-KO isolate and aacA gene decreased 4-fold in aacA-KO isolate. When the results of phenotypic antibiotic susceptibility tests were evaluated, the suppression of mecA, grlA, grlB and aacA genes in the bacteria led to the breakdown of methicillin, quinolone and aminoglycoside resistance. As a result, the strains switched from resistant to susceptible category to the related antibiotics. When the change in PBP2a was analysed by Western blot, a 70% decrease in PBP2a expression was detected in the KO strain compared to WT. According to Sanger sequence analysis, point mutations were detected in grlB and aacA genes, while 3 base substitutions were observed in grlA and mecA genes. Our study is important in terms of showing that CRISPR antimicrobials can be used to eliminate resistance to different antibiotics in many bacteria. Our study also provides data that will form the basis for future studies that will examine the use of CRISPR antimicrobials and traditional antibiotics that cannot be used due to the development of resistance in combined therapy, phage cocktails containing CRISPR-Cas and their combination with nanopharmaceuticals. Keywords; Drug resistance, microbial; Methicillin Resistant Staphylococcus aureus; CRISPR/Cas system
Benzer Tezler
- Staphylococcus aureus izolatlarında agr tiplerinin çeşitli toksin genleri ve antibiyotik direnci ile ilişkisinin saptanması
Determination of the relationship of AGR TYPES with various toxin genes and antibiotic resistance in staphylococcus aureus isolates
YILMAZ PULCU
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2023
MikrobiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DEVRİM DÜNDAR
- Irak'ın Bağdat kentinde klinik örneklerden izole edilen metisilin dirençli staphylococcus aureus izolatlarında mlsb antibiyotik direnç genlerinin belirlenmesi
Determination of mlsb antibiotic resistance genes in metisilin-resistant staphylococcus aureus isolates isolated from clinical samples in the Baghdad of Iraq
ISRAA SALEEM YOUSIF AL-WAELI
- Eritromisin dirençli Staphylococcus aureeus ve koagülaz negtatif stafilokoklarda indüklenebilir MLSB direncinin araştırılması
Invastigation of inducible MLSB resistant in the erythromycin resistant Staphylococcus aureus and coagulase negative staphylococcus
ALİ SERKAN HEPSERT
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2009
MikrobiyolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT GÜNAYDIN
- Klinik örneklerden izole edilen stafilokoklar'da mecA varlığının araştırılması
Investigation of mecA and genes in staphylococci strain isolated from clinical
AYFER KOYUNCU
- Metisiline dirençli staphylococcus aureus saptanmasında fenotipik ve genotipik yöntemlerin karşılaştırılması ve Staphylococcus Aureus'larda klonol yayılımın AP-PCR ile saptanması
Comparison of phenotypic and genotypic methods for the identification of methicillin resistant staphylococcus aureus, and investigation of the spread of these isolotes by AP-PCR
TUBA ATAY
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2001
MikrobiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. ZEYNEP GÜLAY