Identification of the transcriptional regulators of ATB7B gene by genomic locus proteomics and their effect on cisplatin resistance
ATB7B geninin transkripsiyonel regülatörlerinin genomik lokus proteomik yöntemi ile tanımlanması ve cisplatin direncine etkilerinin araştırılması
- Tez No: 817603
- Danışmanlar: PROF. DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Moleküler Tıp, Biology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 106
Özet
ATP7B, hücresel homeostazda hayati bir rol oynayan bir bakır pompasıdır. Bakır birikiminin toksik sonuçlarını önlemek için hücrede biriken fazla metali ekzositoz yolu ile hücreden uzaklaştırır. Yetersiz ATP7B aktivitesi, vücutta bakır toplanmasına neden olarak Wilson hastalığına neden olur. ATP7B'nin expresyonundaki artış ise tam tersine, platin bazlı ilaçların bakırla birlikte hücreden atılmasına neden olarak ilaç direncine yol açar. ATP7B'nin transkripsiyonel seviyede regülasyonunu anlamak, bu genin disregülasyonu sonucu oluşan hastalıkların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olabilir. Metal Düzenleyici Transkripsiyon Faktörü 1 (MTF1), ATP7B'nin en çok çalışılmış transkripsiyonel düzenleyicisidir, ancak ekspresyonu, kanserlerde ATP7B ekspresyonu ile her zaman ilişkili değildir. Bir transkripsiyon faktörünün ekspresyonu her zaman hedef genin ekspresyonu ile ilişkili olmak zorunda değildir. Ancak ATP7B'nin tek bir transkripsiyon faktörü tarafından düzenlenme olasılığı da çok düşüktür, bu da ATP7B'nin düzenleyicilerinin tanımlanması gerekliliğini göstermektedir. ATP7B anlatımını düzenleyen ek faktörleri bulmak için, TRANSFAC/PROMO yazılımı kullanılarak bir in-silico analiz gerçekleştirildi ve birkaç transkripsiyon faktörünün -3000 ila +1 civarında odaklanan ATP7B promotörüne bağlanabileceği bulundu, bu da düzenleyici dizilerin en çok bu bölgede toplandığını göstermektedir. ATP7B ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörlerini tanımlamak için bu tezde“Genomik Lokus Proteomik”adlı yeni bir proximity-labeling metodolojisi kullanılmıştır. Bu teknikte, dCas9 proteini APEX2 enzimi ile birleştirilmiş ve protein, spesifik gRNA'lar aracılığıyla ATP7B promotörüne yönlendirilir. -3000 ila +1 bölgesini kapsayan gRNA'lar, T7E ve ChIP-qPCR deneyleri ile belirlendi. ATP7B promotörünün dCas9 hedefli bölgelerinin yakınındaki proteinler daha sonra APEX2 enzimi ile biyotinlendi ve streptavidin-manyetik bead ile çöktürüldü. İşaretlenen proteinler daha sonra kütle spektrometresi ile tanımlandı ve zenginleştirme puanlarına ve kanserlerde ilaç direnci ile ilişkilerine göre birkaç protein hedef olarak seçildi. ATP7B aktivitesi ile ilişkisini aydınlatmak için hedef gen PINX1 (Pin2/TRF1-Interacting Protein) analiz edildi ve bu genin aşırı ekspresyonunun ATP7B ekspresyonunda bir artışa yol açtığı gösterildi. Ayrıca, HEK293T ve Huh7 hücrelerinde PINX1 aşırı ekspresyonu, sisplatin tedavisine karşı hücre canlılığını arttırdı. Analiz sonuçları PINX1 ve ATP7B arasında transkripsiyonel bir şekilde bir bağlantı olduğunu göstermektedir. Bu ilişki hastalığın ilerlemesine sebep olabilir ve daha etkili tedaviler geliştirmek için kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
ATP7B is a copper pump that plays a vital part in cellular homeostasis. It removes the excess metal from the cells to prevent the toxic results of copper accumulation. Insufficient ATP7B activity results in copper gathering in the body, culminating in Wilson's disease. Upregulation of ATP7B conversely causes the removal of platinum-based drugs along with copper, leading to drug resistance. Understanding the transcriptional regulation of ATP7B may shed light on the mechanisms of disease progression. Metal Regulatory Transcription Factor 1 (MTF1) is a well-studied regulator of ATP7B; however, its expression does not always correlate with ATP7B expression in cancers. The expression of a transcription factor does not always have to be correlated with the expression of the target gene. But the probability that ATP7B is regulated by a single transcription factor is also very low, thus indicating the necessity to identify novel regulators of ATP7B. An in-silico analysis using TRANSFAC/PROMO software was performed to find these additional factors. It was found that several transcription factors may bind to the ATP7B promoter, which was focused around -3000 to +1, indicating that the regulatory sequences are most likely located in this region. A novel proximity labeling methodology called“Genomic Locus Proteomics”was used in this thesis to identify the transcription factors that regulate ATP7B expression. In this technique, the deadCas9 (dCas9) protein is fused to the APEX2 enzyme, and the protein is guided to the ATP7B promoter via specific gRNAs. The efficient gRNAs spanning the -3000 to +1 region were determined by T7E assay and ChIP-qPCR experiments. The proteins near the dCas9-targeted regions of the ATP7B promoter were subsequently biotinylated with the APEX2 enzyme and pulled down with streptavidin-magnetic beads. The marked proteins were then identified with mass spectrometry, and several proteins were selected based on their enrichment scores and their associations with cancer progression and drug resistance in cancers. The target gene PINX1 (Pin2/TRF1-Interacting Protein) was analyzed to illuminate its relationship with ATP7B activity, and it was shown that overexpression of this gene leads to an increase in ATP7B expression. Furthermore, PINX1 overexpression in the HEK293T and Huh7 cells increased the cell viability against cisplatin treatment. This resistance to cisplatin is attributed to the heightened ATP7B activity in the cells. Our findings indicate a transcriptional connection between PINX1 and ATP7B. This relationship may play a role in the progression of the disease and could potentially be utilized to develop more effective therapies.
Benzer Tezler
- The quest for better cancer therapies:Identification of transcription factor involvement in ATP7B regulation via dCas9-Apex2 (Caspex), TOX4 as a potential regulator of Cisplatin resistance
Cisplatin direncini aşma arayışı: ATP7B düzenlemesinde transkripsiyon faktörlerinin dCas9-Apex2 (Caspex) Aracılığıyla Belirlenmesi ve Cisplatin Direncinde Bir Düzenleyici Olarak TOX4'ün tanımlanması
BATUHAN ALTAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyolojiKoç ÜniversitesiHücresel ve Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
DOÇ. DR. NATHAN ALLAN LACK
- Identification of the upstream regulators of interferon regulatory factor 4 (IRF4) expression in melanoma cells
Melanoma hücrelerindeki interferon düzenleyici faktör 4 (IRF4) ekspresyonunun düzenleyicilerinin bulunması
AHMET BUĞRA TUFAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. NEŞET CEVDET TOLGA EMRE
DOÇ. DR. ARZU ÇELİK FUSS
DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN
- Amyotrophik lateral sklerosis hastalarında mikro rna gen ekspresyon profilinin araştırılması
Investigation of the mirna gene expression profile in patients with amtotrophic lateral sclerosis
ÖZLEM KARA
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiÇukurova ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞULE SULTAN MENZİLETOĞLU YILDIZ
- Identification of transcriptional networks controlling themesenchymal-epithelial transition
Mezenkimal-epitelyal dönüşümünü (MET) kontrol eden transkripsiyonel ağların belirlenmesi
BURCU ŞENGEZ
Doktora
İngilizce
2020
BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ HANİ ALOTAİBİ
- Zeytinde biyoinformatik yöntemlerle yeni miRNAların saptanması
Determination of the new miRNAs with bioinformatics methods in olive
DENİZ KARATAY