Turboıd reveals NEK2a's semi-dynamic cell cycle ınteractions and nusap1 as a novel partner
Turboid ile nek2a'nin yari-dinamik hücre döngüsü etkileşimlerinin bulunmasi ve nusap1'in yeni bir partner olarak incelenmesi
- Tez No: 833439
- Danışmanlar: PROF. DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Moleküler Tıp, Biology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 87
Özet
Nek2A, hücre döngüsünde düzenlenen bir kinazdır ve birçok hücresel süreçte yer alırken birçok kanser türünde aşırı üretildiği gözlenmiştir. Nek2'nin kanser üzerindeki rolünü derinlemesine anlamamıza yardımcı olacak olan çalışmamızın başlıca amacı, hücre döngüsü sırasında Nek2A ile etkileşime giren özel partnerleri belirlemektir. Bu amaca ulaşmak için TurboID biyotinleme tekniğini senkronize hücre grupları üzerinde kullanarak, hücre döngüsünün ilerledikçe Nek2A'nın dinamik etkileşimlerini inceledik. Hücrele döngüsünü çift timidin blok yöntemini kullanarak durdurduk ve G1/S, geç S ve G2/M hücre döngüsü evrelerine odaklanarak belirli aralıklarla topladık. Kütle spektrometrisi kullanarak biotinilenmiş proteinleri tanımladık ve bunları MaxQuant, Cassiopeia ve Amica araçlarıyla analiz ettik. Deneylerimiz, daha önce tanınmış Nek2A partnerleri olan Anafazı Teşvik Edici Kompleks (APC) ve Kif24 gibi proteinleri güvenilir bir şekilde tanımladı. Nek2A'nın G1/S, geç S ve G2/M evrelerinde yakından etkileşimde bulunduğu proteinleri western blotlama kullanarak doğruladık. Ko-immünopresipitasyon, Nek2A'nın Nusap1, Kif2c, Mapre3 ve Mpg gibi proteinlerle doğrudan etkileşimlerini ortaya çıkardı. Bu proteinlerin Nek2A ile ko-lokalizasyonunu floresan mikroskopi kullanarak doğruladık. Nek2A partnerlerinden farklı bir rol üstlenen Nusap1'e özel bir ilgi gösterdik. Nusap1, DNA hasarı proteinlerinin stabilizatörü olarak çalışır ve onun azalması DNA iplikçik kırıklarına yol açarak hücrenin hayatta kalmasını olumsuz etkileyebilir. Analizlerimiz, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında ubikitinleme tarafından yönlendirilen proteolizin yaygın bir şekilde meydana geldiğini gösterdi. İlk olarak, Nek2A aktivitesi azalmış veya artmış hücrelerde Nusap1'in protein miktarını inceledik. İlginç bir şekilde, siRNA tedavisi sonrasında ve iki farklı Nek2 null (KO) hücre varyantında Nusap1 seviyelerinde artış gözledik. Nek2A'nın aşırı ifadesi ise, diğer hücre mekanizmalarının muhtemelen dengelenmesi öncesinde yalnızca 6 saat süren Nusap1 miktarında bir kısa süreli azalmaya neden oldu. Bu azalmayı MG132 adlı iyi bilinen proteazom inhibitörü kullanarak tersine çevirebildik. Ayrıca, Nek2A KO hücrelerinde Nusap1'in ubikitinasyonunda dikkate değer bir azalma gözlemledik. Bu durumun proteazomal bozulma süreçlerinin rolünü işaret ettiğini hipotezledik. Ayrıca, Nek2A knock out hücrelerde Nusap1 dahil birçok proteini içeren geniş bir protein analizi, azalan ifadelerini doğruladı. Özetle, bulgularımız Nusap1'i yeni bir Nek2A partneri olarak işaret etti ve Nek2A'nın olası olarak Nusap1'in ubikitinasyon yoluyla parçalanmasını etkileyebileceğini düşündürdü. Bu etkileşimin tam doğası ve klinik önemi daha fazla araştırmalar yapılarak aydınlatılacaktır.
Özet (Çeviri)
Nek2A is a cell cycle regulated kinase, which is involved in several cellular processes and overexpressed in numerous cancer types. It has been associated with chromosome instability, increased cell proliferation and drug resistance in cancers. Our study primarily aims to identify the specific partners that interact with Nek2A during the cell cycle, deepening our understanding of Nek2's role in cancer. To meet this objective, we employed the TurboID proximity labeling technique on synchronized cell groups, exploring the dynamic interactions of Nek2A as the cell cycle advances. We synchronized the cells using a double thymidine block and harvested them at designated release time points, focusing on G1/S, late S, and G2/M cell cycle phases. Through mass spectrometry, we identified biotinylated proteins, which we further analyzed using MaxQuant, Cassiopeia, and Amica tools. Our experiments reliably identified previously recognized Nek2A partners like the Anaphase Promoting Complex (APC) and Kif24. We confirmed proteins closely interacting with Nek2A during the G1/S, late S, and G2/M stages using western blotting. Co-immunoprecipitation unveiled direct interactions of Nek2A with proteins such as Nusap1, Kif2c, Mapre3, and Mpg. We also confirmed the colocalization of these proteins with Nek2A using fluorescence microscopy. We took a special interest in Nusap1 due to its unique role, distinct from other Nek2A partners. Nusap1 acts as a stabilizer for DNA damage proteins, and its depletion can lead to DNA strand breaks, negatively impacting cell survival. Our analysis highlighted a prevalent occurrence of ubiquitin-driven proteolysis during the cell cycle's progression. We initially studied Nusap1's expression in cells with either diminished or amplified Nek2A activity. Remarkably, there was an increase in Nusap1 levels post-siRNA treatment and in two distinct Nek2 null (KO) cell variants. Conversely, overexpression of Nek2A led to a short-lived reduction in Nusap1 amounts, lasting just 6 hours, before other cell mechanisms presumably balanced it. Using the well- known proteasome inhibitor, MG132, we were able to counteract this reduction. Moreover, we observed a notable reduction in Nusap1 ubiquitination in Nek2A KO cells, pointing to the possible role of proteasomal breakdown processes. A broad protein analysis in Nek2A deficient cells confirmed many proteins, including Nusap1, showed decreased expression. In essence, our findings indicate Nusap1 as a new Nek2A partner, with Nek2A possibly affecting Nusap1's degradation through ubiquitination. The exact nature of this interaction and the clinical significance require further exploration.
Benzer Tezler
- Escherıchıa colı hücre yüzey proteinlerinin biyotinilasyonu ve NLC-MS/MS analizi
Biotinylation and NLC-MS/MS analysis of cell surface proteins of escherichia coli
ELİFCAN KOÇYİĞİT
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Tıbbi BiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT KASAP
- Şekillendirilmiş lazer hüzmelerinin yüksek saçılmalı ortamla etkileşimleri
Interactions of shaped laser beams with highly scattering media
TANSU ERSOY
Doktora
Türkçe
2016
Fizik ve Fizik Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiFizik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SELÇUK AKTÜRK
- Bölünmüş-TurboID Biyotinilasyon Enzim Teknolojisi kullanarak çekirdek proteinlerinin seçici biyotinilasyonu için füzyon proteinlerin nükleusa yönlendirilmesi ve doğrulanması
Directing and validation of fusion proteins into the nucleus for selective biotinylation of nuclear proteins via adaptation of Split-TurboID Biotinylation Enzyme Techonology
FATMA ZEHRA ÖZEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Tıbbi BiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT KASAP
- Sağlıklı ve kanserli meme hücre hatlarında biyotinilasyon yardımıyla karşılaştırmalı sekretom analizi
Comparative secretome analysis with the aid of biotinylation in healthy and cancerous breast cell lines
ELİF AKINCI
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Tıbbi BiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GÜRLER AKPINAR
- Meme kanseri hücre hatlarında karşılaştırmalı yüzey proteom analizi
Comparative surface proteome analysis in breast cancer cell lines
MEHMET SARIHAN
Doktora
Türkçe
2023
Tıbbi BiyolojiKocaeli ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT KASAP