Meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231'in çekirdek proteomunun split-turboıd teknolojisi kullanılarak çalışması
Study of the nuclear proteome of the MDA-MB-231 breast cancer cell line using split-turboid technolog
- Tez No: 919951
- Danışmanlar: PROF. DR. MURAT KASAP
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Kocaeli Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 58
Özet
Hücre çekirdeği, genetik materyalin büyük bölümünü barındıran ve gen ekspresyonunu düzenleyerek hücresel aktiviteleri kontrol eden önemli bir organeldir. Nükleer DNA, çeşitli proteinlerle organize edilmiş yapılarla hücrenin işlevini destekleyecek şekilde korunur ve düzenlenir. Çekirdek, bu genetik bilgiyi korurken aynı zamanda birçok fizyolojik olayın gerçekleştiği dinamik bir merkezdir. Organellerin proteomik çalışmaları, hücresel sinyal iletim yollarını ve hücresel işlevlerin moleküler temelini anlamak için kritik öneme sahiptir. Ancak organel proteom analizleri, zenginleştirilen protein fraksiyonlarında organelin gerçek bileşeni olmayan moleküllerin yer alması gibi zorluklarla karşılaşır. Ayrıca, farklı hücre tipleri ve dokular arasında organel bileşimindeki değişiklikler, analizlerde dikkate alınması gereken önemli unsurlardır. Organellerde yer alan birçok protein post-translasyonel modifikasyonlara uğradığı için bu modifikasyonların incelenmesi işlevsel analizler açısından önemlidir. Bu çalışmada, çekirdek proteinlerinin biyotinilasyonu ve zenginleştirilmesi amacıyla Split TurboID biyotin ligaz teknolojisi kullanılarak yeni bir model hücre hattı oluşturulmuştur. Split TurboID, inaktif halde bulunan iki domainin (N-terminal ve C- terminal) rapamisin varlığında birleşerek aktif hale gelmesi ile yakınsal biyotin etiketlemesi gerçekleştirir. Bu sistem, FKBP ve FRB proteinlerini içeren füzyon proteinleri ile daha önceden tasarlanmıştır ve hücre içi biyotinilasyon kontrollü bir şekilde sağlanmıştır. Nükleer proteinlerin biyotinilasyonu, tetrasiklin-indüklenebilir bir sistem aracılığıyla kontrol edilerek çekirdek proteinlerinin enzimatik biyotinilasyonu gerçekleştirilmiştir. MDA-MB-231 meme östrojen ve progesteron duyarsız triple negatif hücre hattı olup agresif seyreden meme kanseri hücrelerini temsil eder. Bu hücrelerde kontrollü gen ifadesi yapabilmek için TetR represör proteinini ifade etmelerini sağlama gerekir. Bu amaçla MDA- MB-231 hücrelerine TetR represör proteinini kodlayan pcDNA6/TR plazmiti transfekte edilmiş ve blasticin antibiytoiği ile seçilim yapılarak monklonal bir hücre hattı oluşturulmuştur. Elde edilen TetR+ monoklonal hücre hattına bir sonraki adımda Split TurboID-N terminalini kodlayan pcDNA4/TO plazmiti transfekte edilmiş ve zeosin varlığında seçilim yapılarak monoklonal bir hücre hattı oluşturulmuştur. Çalışmanın son aşamasında ise elde edilen TetR+ ve SplitTurboID-N terminal+ monoklonal hücre hattına Split TurboID-C terminalini kodlayan pcDNA3.1 plazmiti transfekte edilmiş, ve hücreler genetisin ile seçilime tabi tutularak monoklonal bir hücre hattı oluşturulmuştur. Oluşturulan bu hücre hattı Split-TurboID enziminin N-terminal domainini tetrasiklin kontrolünde ifade ederken C-ucunu sürekli ifade etmektedir. Ayrıca, biyotinilasyon aktivitesinin sıkı bir şekilde kontrol edilebilmesi için aktif enzim oluşumu rapamisin indüksiyonuna bağlanmıştır. Kısaca, tez kapsamında geliştirilen hücre hattında tetrasiklin ve rapamisin varlığında varlığında N-terminal ve C-terminal domainleri birleşerek aktif TurboID enzimini oluşturmuş, biyotin ve ATP'nin varlığında çekirdek proteinlerinin biyotinilasyonunu gerçekleştirmiştir. Bu biyotinilasyon işlemi, immün floresan ile doğrulanmış ve çekirdek lokalizasyonu gözlenmiştir. Böylece yeni bir model hücre hattı elde edilmiştir.
Özet (Çeviri)
The nucleus is an important organelle that houses the majority of genetic material and regulates cellular activities by controlling gene expression. Nuclear DNA is preserved and organized into structures with various proteins to support the function of the cell. While the nucleus safeguards this genetic information, it also serves as a dynamic hub where numerous physiological processes occur. Proteomic studies of organelles are critical for understanding cellular signaling pathways and the molecular basis of cellular functions. However, organelle proteomics face challenges, such as the presence of non-organelle- specific molecules in the enriched protein fractions. Additionally, variations in organelle composition between different cell types and tissues are important factors that must be considered in the analyses. Since many proteins within organelles undergo post-translational modifications, examining these modifications is essential for functional analyses. In this study, a novel cell model was created using Split TurboID biotin ligase technology to biotinylate and enrich nuclear proteins. Split TurboID allowed proximity- based biotin labeling by the assembly of two inactive domains (N-terminal and C-terminal), which become active upon dimerization in the presence of rapamycin. This system was previously designed with fusion proteins containing FKBP and FRB proteins, enabling controlled intracellular biotinylation. Nuclear protein biotinylation was achieved by controlling the enzymatic biotinylation of nuclear proteins through a tetracycline-inducible system. In the MDA-MB-231 cell line, a tetracycline-inducible model was created by transfecting with the pcDNA6/TR plasmid. The fusion protein containing the Split TurboID N-terminal domain was cloned into the pcDNA4/TO plasmid, enabling expression in the presence of tetracycline. Similarly, the fusion protein containing the Split TurboID C- terminal domain was cloned into the pcDNA3.1 plasmid, which was constitutively expressed in the cell. In the presence of tetracycline and rapamycin, the N-terminal and C-terminal domains combined to form the active TurboID enzyme, which biotinylated nuclear proteins in the presence of biotin and ATP. This biotinylation process was validated by immunofluorescence microscopy analysis. Nuclear localization of the biotinylated proteins was observed indicating successful creation of a novel cellular model.
Benzer Tezler
- Kansere karşı çok yönlü tedavi aracı olarak manyetik nanopartiküllerin geliştirilmesi
Development of magnetic nanoparticles as a potential multi-therapy agent against cancer
KÜBRA SOLAK
Doktora
Türkçe
2023
BiyomühendislikAtatürk ÜniversitesiNanobilim ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET MAVİ
- Meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231 üzerine Cladonia furcata'nın koruyucu etkisinin belirlenmesi
Protective effects of Cladonia furcata on MDA-MB-231 breast cancer cell line
ELİF AKBULUT
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyolojiYozgat Bozok ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSTAFA KOCAKAYA
- İndoksakarb'ın meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231 üzerine toksik etkileri
Toxic effects of indoxacarb on MDA-MB-231 breast cancer cell line
BEYZA ÖZDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyolojiYozgat Bozok ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK PANDIR
- Bendiokarb'ın meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231 üzerine toksik etkileri
Toxic effects of bendiocarb on MDA-MB-231 breast cancer cell line
DERYA GÜL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyolojiYozgat Bozok ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK PANDIR
- Capsaicinin MDA-MB-231 hücre hattına etkisi ve sodyum selenitin koruyucu rolünün belirlenmesi
Effects of capsaicin on cell line of MDA-MB-231 and protective role of sodium selenite
BEDİHA KÖSE