Metabolomik ve genomik yaklaşımlarıyla Escherichia coli'de benzoik asit ve ferulik asit ile ilgili genlerin araştırılması
Investigation of benzoic acid and ferulic acid related genes in Escherichia coli with metabolomic and genomic approaches
- Tez No: 844010
- Danışmanlar: DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Benzoik asit, Ferulik asit, ASKA, Escherichia coli, gen, metabolit, Benzoic acid, Ferulic acid, ASKA, Escherichia coli, gene, metabolite
- Yıl: 2021
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 177
Özet
Fenolik bileşikler, başta bitkiler olmak üzere farklı canlı gruplarında biyosentezi gerçekleşen sekonder metabolitlerdir. Bu bileşiklerin, bitkilerin UV'ye karşı korunması, patojenlere karşı savunması gibi çevresel streslere karşı yanıtta üretilmeleri, antibakteriyel, antioksidan, antikanser, antiviral gibi birçok önemli aktiviteye sahip olmaları dikkat çekmektedir. Fenolik bileşiklerin biyoaktif özelliğe sahip olmaları ve diyet alımı ile insan sağlığı üzerinde gösterdikleri olumlu etkilerinden dolayı, bu bileşiklerden sağlık sektörü dahil birçok sektörde doğal bileşikler olarak yararlanılmaktadır. Ancak hücre içerisinde hangi genler ve metabolitler ile etkileşim içerisinde oldukları tam olarak bilinmemektedir. Bu bileşiklerin daha etkin bir şekilde kullanılabilmeleri için, canlılar ve insan sağlığı üzerindeki potansiyel rolleri hakkında bilgilerin arttırılması, çalışmaların hücrede gen/genom düzeyinde detaylandırılması, hücre içerisinde etkileşimde olduğu yolakların belirlenmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasında, fenolik bileşiklerden benzoik asit ve ferulik asitin Escherichia coli bakterisinde ilişkili olduğu gen ve metabolitlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmalarda genomik, gen ekspresyon ve metabolomik analizlerinin yanı sıra, çeşitli mikrobiyoloji deneyleri ve istatistiksel analiz yöntemleri uygulanmıştır. Tezin ilk kısmında, ASKA klon setindeki 4123 adet klonun bir araya getirilmesiyle oluşturulan ASKA plazmit genom boyu kütüphanesi ile genomik çalışmalar yürütülmüştür. ASKA plazmit genom boyu kütüphanesi, gradient ekim yöntemi kullanılarak farklı konsantrasyonlarda benzoik asit ve ferulik asit stresine maruz bırakılmıştır. Benzoik asit gradient ekim seleksiyonundan 91 adet ve ferulik asit gradient ekiminden ise 132 adet göreceli olarak yüksek tolerans seviyesine sahip suş belirlenmiştir. Bu suşların toleranslı olduklarının onaylanması ve ek bir seleksiyon yapılması için çizgi ekim yöntemi kullanılmıştır. Bu bileşiklerle yapılan seleksiyon çalışmaları sonucu toleranslı olduğu onaylanan suşlardan seçilerek koloni PCR yapılmış ve insert büyüklüklerine bakılmıştır. Benzoik asit ile ferulik asit'ten 6'şar adet suş seçilerek plazmit izolasyonu ve sekans analizi gerçekleştirilmiştir. Sekans analizi sonrası insert bilgilerine ulaşılan klonlar, yjtD, yabQ, ydfB, yegP, osmE, hisS (benzoik asit) ile prpE, sbmC ve fliS (ferulik asit) genlerini taşımaktadır. Tez çalışmasının diğer bir kısmında her bileşik için klonlardan seçilerek, yabanıl tip Escherichia coli'de gen ekspresyon analizi yapılmıştır. Real-Time PCR deneylerinde osmE ve prpE genlerinin ekspresyon seviyelerinde artış olduğu gözlenmiştir. Tez çalışmasının son kısmında, benzoik asit ve ferulik asit stresi ile ilgili metabolitlerin belirlenmesinde 1H-NMR analizi kullanılmıştır. 1H-NMR analizi için metabolit ekstraktları, 4 konsantrasyon, 3 tekrar olacak şekilde her bileşik için ayrı ayrı olarak E.coli BW25113 suşu kullanılarak hazırlanmıştır. Benzoik asit'in E.coli BW25113 suşu ile yapılan 1H-NMR analizi sonucu 80 adet metabolit profiline ulaşılmıştır. 80 adet metabolit ile yapılan istatistiksel analizlerde kontrol grubuna kıyasla, 24 adet metabolitin konsantrasyonlarında, en az bir benzoik asit konsantrasyon uygulamasında, anlamlı değişim olduğu gözlenmiştir. Benzoik asit ile E.coli BW25113 suşu NMR analizi sonrası istatistiksel analizlerde Sükroz, IMP, Pantotenat, Kreatin, Mannitol, Uridin, Glisin, Adenozin, Sitidin, Histamin, Putresine, N6-Acetillizin, 2-Aminobutirat, dTTP, Ksantin, 2-Oksoizokaproat, Asetamid, Inozin, Hydroksiaseton, Glikolat, Guanozin, Kreatin fosfat, Betain ve Malat metabolit konsantrasyonlarında kontrol grubuna kıyasla anlamlı değişimler olmuştur. Benzoik asit ile E. coli BW25113 suşunun NMR analizinde“Galaktoz (Galactose)”,“Nişasta ve sükroz (Starch and sucrose)”,“Pürin (Purine)”,“Pirimidin (Pyrimidine)”ve“Glisin, serin ve treonin (Glycine, serine and threonine)”metabolik yolaklarının etkilendiği görülmüştür. Ferulik asit ile yapılan NMR analizi sonucu 71 adet metabolit profiline ulaşılmıştır. 71 adet metabolit ile yapılan istatistiksel analizler sonucu 41 adet metabolit konsantrasyonunda, en az bir ferulik asit uygulamasında kontrol grubuna kıyasla değişim olduğu görülmüştür. Anlamlı değişim gözlenen metabolitler, Asetamid, Fumarat, Urasill, Oksipürinol, N-Asetilornitin, Glikolat, Eritritol, Süksinat, Trimetilamin N-oksit, Hidroksiaseton, N-Asetilglukozamin, Piroglutamat, Betain, Izositrat, Malat, dTTP, Niasinamid, Etilen glikol, Piruvat, Fruktoz, Adenozin, AMP, Kreatin fosfat, Inozin, Histamin, O-fosfokolin, Sitidin, Sitozin, Maleat, Piridoksin, Metiyonin, Glutamat, Malonat, Kadaverin, Guanozin, Alanin, Tartarat ve Sebakat' dır. Ferulik asit ile E.coli BW25113 suşunun NMR analizinde etkilenen metabolik yolaklar ,“Trikarboksilik asit döngüsü (TCA cycle)”,“Glutatyon (Glutathione)”,“Propanoat (Propanoate)”,“Sülfür (Sulfur)”,“Metan (Metan)”,“Bütanoat (Butanoate)”,“Arjinin biyosentesi (Arginin biosynthesis)”,“Nikotinat ve nikotinamid (Nicotinate and nicotinamide)”,“Lizin degredasyonu (Lysin degradation)”,“Alanin, aspartat ve glutamat (Alanin, aspartate and glutamate)”,“Piruvat (Pyruvate)”,“Glioksilat ve dikarboksikat (Glyoxylate and dicarboxylate)”,“Glikoliz/glikoneogenez (Glycolysis/gluconeogenesis)”,“Pürin (Purine)”,“Glisin, serin ve treonin (Glycin, serine ve threonine)”,“Pirimidin (Pyrimidine)”,“Fruktoz ve mannoz (Fructose ve mannose)”ve“Nişasta ve sükroz (Starch and sucrose)”'dur. Bu tez çalışmasıyla, benzoik asit ve ferulik asit'in E. coli bakterisinde doğrudan veya dolaylı ilişkili olabileceği gen ve metabolitler önerilmiştir.
Özet (Çeviri)
Phenolic compounds are secondary metabolites whose biosynthesis takes place in different living groups, especially plants. It is noteworthy that these compounds are produced in response to environmental stresses such as protection of plants against UV, defense against pathogens, and have many important activities including antibacterial, antioxidant, anticancer, antiviral. Due to the bioactive properties of phenolic compounds and their positive effects on human health even with dietary intake, these compounds are used as natural compounds in many sectors, including the health sector. However, it is not known exactly which genes and metabolites they interact with in the cell. In order for these compounds to be used more effectively, it is necessary to expard the knowledge about their potential roles on living things and human health, to detail the studies at the gene/genome level in the cell, and to determine the pathways in which they interact within the cell. In this thesis, it was aimed to determine the target genes and metabolites associated with phenolic compounds benzoic acid and ferulic acid in Escherichia coli bacteria. In addition to genomic, gene expression and metabolomic analyzes, various microbiology experiments and statistical analysis methods were applied in the studies. In the first part of the thesis, genomic studies were carried out with the ASKA plasmid genome-wide library, which was created by combining 4123 clones in the ASKA clone set. The ASKA plasmid genome-wide library was exposed to different concentrations of benzoic acid and ferulic acid stress using gradient cultivation method. 91 strains from benzoic acid gradient cultivation and 132 strains with relatively high tolerance level were determined from ferulic acid gradient selection. Streaking method was used to confirm the tolerance of these strains and to perform an additional selection. Colony PCR was performed by selecting strains that were confirmed to be tolerant as a result of selection studies with these compounds and insert sizes were examined. Plasmid isolation and sequence analysis were performed by selecting 6 strains from benzoic acid and ferulic acid. Tolerant clones, whose insert information was obtained after sequence analysis, were found to carry yjtD, yabQ, ydfB, yegP, osmE, hisS (benzoic acid) and prpE, sbmC and fliS (ferulic acid) genes. In another part of the thesis study, gene expression analysis was performed in wild type Escherichia coli by selecting from tolerant clones for each compound. In Real-Time PCR experiments, an increase in the expression levels of osmE and prpE genes was observed. In the last part of the thesis studies, 1H-NMR spectroscopy analysis was used to determine the metabolites related to benzoic acid and ferulic acid stress. Metabolite extracts for 1H-NMR analysis were prepared in 4 concentrations, 3 replicates separately for each compound using E.coli BW25113 strain. As a result of 1H-NMR analysis of benzoic acid with E.coli BW25113 strain, 80 metabolites were obtained. In the statistical analyzes performed with 80 metabolites, a significant change was observed in the concentrations of 24 metabolites compared to the control group, in at least one benzoic acid concentration application. Sucrose, IMP, Pantothenate, Creatine, Mannitol, Uridine, Glycine, Adenosine, Cytidine, Histamine, Putrescine, N6-Acetyllysine, 2-Aminobutyrate, dTTP, 2-Aminobutyrate, Oanithine, in statistical analysis after benzoic acid and E.coli BW25113 strain NMR analysis There were significant changes in metabolite concentrations of Acetamide, Inosine, Hydroxyacetone, Glycolate, Guanosine, Creatine phosphate, Betaine and Malate compared to the control group. In NMR analysis of E. coli BW25113 strain with benzoic acid,“Galactose (Galactose)”,“Starch and sucrose (Starch and sucrose)”,“Purine (Purine)”,“Pyrimidine (Pyrimidine)”and“Glycine, serine and threonine (Glycine)”, serine and threonine)“ metabolic pathways were found to be affected. As a result of NMR analysis with ferulic acid, 71 metabolite profiles were obtained. As a result of the statistical analyzes performed with 71 metabolites, it was observed that there was a change in the concentration of 41 metabolites in at least one ferulic acid application compared to the control group. Metabolites with significant changes, Acetamide, Fumarate, Uracil, Oxypurinol, N-Acetylornithine, Glycolate, Erythritol, Succinate, Trimethylamine N-oxide, Hydroxyacetone, N-Acetylglucoseamine, Pyroglutamate, Betaine, Isocitrate, Malateyl glycolamide, Erythyl glycoseamine, , Fructose, Adenosine, AMP, Creatine phosphate, Inosine, Histamine, O-phosphocholine, Cytidine, Cytosine, Maleate, Pyridoxine, Methionine, Glutamate, Malonate, Cadaverine, Guanosine, Alanine, Tartrate and Sebacate. Metabolic pathways affected in NMR analysis of ferulic acid and E. coli BW25113 strain, ”Tricarboxylic acid cycle (TCA cycle)“, ”Glutathione (Glutathione)“, ”Propanoate (Propanoate)“, ”Sulfur (Sulfur)“, ”Methane (Methane)“, ”Butanoate (Butanoate)“, ”Arginine biosynthesis (Arginine biosynthesis)“, ”Nicotinate and nicotinamide (Nicotinate and nicotinamide)“, ”Lysin degradation“, ”Alanine, aspartate and glutamate (Alanin, aspartate and glutamate) )“, ”Pyruvate (Pyruvate)“, ”Glyoxylate and dicarboxylate (Glyoxylate and dicarboxylate)“, ”Glycolysis/gluconeogenesis (Glycolysis/gluconeogenesis)“, ”Purine (Purine)“, ”Glycine, serine and threonine (Glycin, serine and threonine)“, ”Pyrimidine (Pyrimidine)“, ”Fructose and mannose (Fructose and mannose)“ and ”Starch and sucrose (Starch and sucrose)". In this thesis, the genes and metabolites that may be associated with benzoic acid and ferulic acid in E. coli bacteria were determined.
Benzer Tezler
- Genom boyu taramaları ve moleküler genetik yaklaşımlarıyla Escherichia coli bakterisinde bor toleransı ile ilgili genlerin araştırılması
Investigation of genes related to boron tolerance in Escherichia coli using genome-wide screening and molecular genetic approaches
MERVE SEZER
- Karasal aktinomisetlerde yeni ilaç adaylarınıın kimyasal ve genomik olarak taranması
Screening of novel drug candidates in terestrial actinomycetes by using chemical and genomic tools
EKREM KUM
- Adaptive response to fluconazole in candida parapsilosis: Ergosterol pathway mutations, gene expressions, and metabolomic shifts
Candida parapsilosis'te flukonazole uyum yanıtı: Ergosterol yolağı mutasyonları, gen ekspresyonları ve metabolomik değişimler
KÜBRA ÇAM
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
MikrobiyolojiKoç ÜniversitesiSağlık Bilimleri Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZLEM DOĞAN
- IVF kültür sıvısının pre implant genetik tanı amaçlı genomik ve metabolomik analizi
Genomic and metabolomic analyses of IVF culture medium for preimplantation genetic diagnosis
İBRAHİM ORÇUN OLCAY
Doktora
Türkçe
2022
BiyokimyaAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar ÜniversitesiBiyokimya ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYSEL ÖZPINAR
PROF. DR. MUSTAFA CENGİZ YAKICIER
- Doğal renkli pamuk (Gossypium hirsutum L.) üzerinde biyoteknolojik çalışmalar
Biotechnological studies on naturally colored cotton (Gossypium hirsutum L.)
ONUR AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NESLİHAN TURGUT KARA