Geri Dön

Identification of bacilysin producer cells during biofilm formation in Bacillus subtilis

Bacillus subtilis'de olgunlaşmış biyofilm yapısında basilisin üreten hücrelerin belirlenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 568393
  2. Yazar: EZGİ KOMAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 87

Özet

Gram pozitif bakteriler arasında yer alan Bacillus subtilis çubuksu yapıya sahip, patojen olmayan, mezofilik, özellikle toprak, bitki kökleri veya hayvanların gasterointestinal sistemlerinde yaşayan bir bakteri türüdür. B. subtilis besin kıtlığı veya çevresel stresler gibi ortamından aldığı sinyallere ve büyüme koşullarına göre fizyolojik durumunu değiştirebilen, yüksek adaptasyon kabiliyetine sahip bir bakteridir ve bu değişimler morfolojik ve fenotipik olarak da gözlemlenebilmektedir. Fizyolojik durum değişikliğini tetikleyen sebepler arasında çevredeki besin kaynaklarının ulaşılabilirliği, kullanılabilirliği ve onlara karşı olan rekabet, ortamın pH değeri, sıcaklığı ve oksijen miktarı gösterilebilir. Bu fizyolojik durum değişikliklerine bakterinin verdiği adaptif cevaplar arasında da sporulasyon, kemotaksis, genetik kompetans gelişimi ve antibiyotik üretimi sayılabilir ve tüm bunlar hücre yoğunluğunun algılanmasına bağlı oluşan sinyalizasyon ağı (quorum sensing) tarafından düzenlenmektedir. Eğer logaritmik büyüme evresi sonunda, B. subtilis hücreleri sınırlı besin kaynağı sinyali alırsa, bu durumdan kaçınabilmek için kemotaksis (kimyasala yönelim) ya da hareketlilik (motilite) özelliklerini geliştirmektedir. Bu besinsel kıtlık durağan büyüme evresinde hala devam ediyorsa, B. subtilis çevredeki alternatif gıda kaynaklarını parçalayacak proteazlar gibi ya da ortamda üstünlük elde etmesini sağlayacak antibiyotikler gibi ikincil metabolitler üreterek dış ortama gönderebilmektedir. Daha ileri safhalarda ise, hücreler kompetans geliştirip dışarıdaki DNA parçalarını içine alarak genetik çeşitliliğini arttırmaktadır. Tüm bu adaptif tepkilerin yetersiz kaldığı durumda ise B. subtilis son çare olarak hayati fonksiyonlarını durdurarak spor oluşturmaktadır. Biyofilm, bakteriler tarafından üretilen hücredışı polimerik maddelerle (EPS) çevrili, bakterilerin geri dönüşümsüz olarak bir yüzeye veya birbirlerine yapıştıkları mikrobiyal hücre kümeleri olarak tanımlanmaktadır. Biyofilm besin kıtlığı gibi çevresel değişimlere karşı geliştirilen bir adaptasyon olarak, bakteriler arasındaki iletişime dayanan gen ekspresyonunun düzenlenmesi sonucu oluşur ve topluluk içindeki bakterilere antibiyotiklerden veya dezenfektanlardan korunma gibi çeşitli avantajlar sağlar. B. subtilis NCIB 3610 yaban suşu kompleks, damar benzeri görünüme sahip, kalın biyofilm yapıları oluştururken PY79 gibi evcileştirilmiş laboratuvar suşları belirgin şekilde zayıflatılmış, ince, kırılgan, ayırt edici bir makroskopik yapıya sahip olmayan hücre toplulukları oluşturmaktadır. B. subtilis genomunun tamamı dizilenmiş, iyi bilinen ve patojen olmayan bir model organizma olması sebebiyle biyofilm çalışmalarında tercih edilmektedir. Biyofilm oluşumu, bazı dış sinyallere cevap olarak matris genlerinin ifadesiyle başlar. Başlangıçta, hücreler kısa, hareketli, çubuk şeklindedir ancak biyofilm geliştikçe, hücre dışı bir matris salgılayıp birbirlerine ve yüzeye yapışarak hareketli olmayan uzun hücre zincirlerini oluştururlar. Biyofilm olgunlaşma sürecinde, genetik olarak aynı B. subtilis hücreleri, farklı genleri ifade eder ve popülasyon içinde farklı fonksiyonları yerine getiren hücre tiplerine özelleşirler. Olgun biyofilmler, mekansal olarak organize olmuş çok sayıda ve bir arada var olan hücre tipini içerir. Bunlar uzun zincirler oluşturup birbirlerine ürettikleri hücre dışı matris ile tutunan hareketsiz hücreler, hareketli kısa çubuk şeklindeki hücreler ve sporlanan hücrelerdir. B. subtilis popülasyonunun çeşitli hücre tiplerine farklılaşması, hücre yoğunluğunun algılanmasına bağlı oluşan sinyalizasyon ağı (quorum sensing) ve onu kontrol eden sinyalleşme ağlarındaki heterojenliğin bir araya gelmesiyle artar. Bacillus suşları tarafından üretilen basilisin çeşitli bakterilere ve bazı mantarlara karşı antimikrobiyal etki gösteren, L-alanin ve protein kökenli olmayan L-anticapsin'den oluşan basit yapılı bir dipeptit antibiyotiktir. Basilisinin antimikrobiyal aktivitesi yapısındaki L-anticapsinden kaynaklanmaktadır. Polisistronik bacABCDEF (eski ismiyle ywfBCDEFG) operonunun, monosistronik bacG (ywfH) geni ile birlikte basilisin biyosentezinden sorumlu olduğu bilinmektedir. bacABCDF ve bacG basilisinin L-anticapsin oluşumu ve L-alanin ile ligasyonu gibi üretim aşamalarında görev alırken, bacE antibiyotiğin dışarı sentezlenerek üretici organizmanın korunmasından sorumludur. Basilisin biyosentezi ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA etkisinde hücre yoğunluğuna bağlı sinyalizasyon ağı tarafından kontrol edilir ve Spo0K (Opp)'ya bağlı bir şekilde gerçekleşir. İkincil metabolit olan antibiyotiklerin, üretici organizmaya kazandırdıkları antimikrobiyal aktivite dışında tür içi yada türler arası iletişimde kullanılan anahtar sinyal molekülü gibi farklı görevleri olup olmadığı hep merak konusu olmakta ve en popüler çalışma konularını oluşturmaktadır. Basilisinin özellikle araştırma grubumuzda yürütülen çalışmalarla B. Subtilis'de çoklu etkiye sahip bir regülatör sinyal peptiti (feromon) olabileceği gösterilmiştir. Bu bulgunun temeli laboratuvar grubumuz tarafından yapılmış olan basilisin üreten B. subtilis PY79 ve onun basilisin üretmeyen mutant türevi ile basilisin üretim besiyeri olan PA ortamında karşılaştırmalı transkriptom analizlerine dayanmaktadır. Bu analizler basilisinin kompetans gelişimi, sporulasyon ve biyofilm oluşumu gibi birçok adaptif cevap oluşumunda düzenleyici etkisi olduğunu işaret etmektedir. Bu çalışmalara ek olarak B. Subtilis NCIB 3610 suşunun normal şartlarda biyofilm oluşturamadığı kompleks bir besi yeri olan Luria Broth (LB) içerisine basilisin ekstraktı eklendiğinde yüzeyde kırılgan yapıda ince bir biyofilm oluşturduğu gözlemlenmiştir. En önemli çalışma ise, srfA operonu tarafından ifade edilen sürfaktin antibiyotiğinin B. Subtilis'de biyofilm oluşumunu tetikleyen bir hücre yoğunluğunun algılanmasına bağlı oluşan sinyalizasyon ağı molekülü olduğunun bulunmasıdır. Biyofilm yapısındaki hücrelerin çoğunluğu ComX üretebilirken, yalnızca küçük bir alt populasyon ComX'e yanıt olarak sürfaktin üretebildiği ve sürfaktin ise başka bir hücre kümesini matriks üretici hücrelere dönüştürdüğü bulunmuştur. Daha önceki çalışmamızda, srfA operonun inaktive edilmesi sonucunda basilisinin biyosentezinin durması ile sonuçlanması, aynı zamanda sürfaktin biyosentezinde olduğu gibi basilisin biyosentezinin de hücre yoğunluğuna bağlı sinyalizasyon ağı molekülü olan ComX tarafından tetiklenmesi, sürfaktin gibi basilisinin de biyofilm oluşumu sürecinde düzenleyici rolü olabileceği ihtimaline işaret etmektedir. Tüm bu bilgilerin ışığında, bu proje kapsamında, basilisinin de sürfaktin gibi hücre yoğunluğuna bağlı sinyalizasyon ağı molekülü olup olmadığı bilgisine ulaşmamızı sağlayacak çalışmaların başlangıç bulgusunu oluşturacak, biyofilm yapısı içerisinde bulunan farklılaşmış hücre toplulukları arasında basilisin biyosentezinin özelleşmiş belirli hücre tipleri tarafından üretilip üretilmediği ihtimalinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla öncelikle basilisin biyosentezinden sorumlu bacABCDEF operonunun promotör bölgesi (Pbac) ve yeşil floresan proteinini (GFP) kodlayan açık okuma bölgesi ile transkripsiyonel bir füzyon oluşturulmuştur. Oluşturulan Pbac::gfp vektörü biyofilm oluşturabilen yabanıl bir suş olan B. subtilis NCBI 3610 transforme edilerek amyE::Pbac::gfp 3610 rekombinant suşu elde edilmiştir. B. subtilis NCBI 3610 rekombinant suşu biofilm oluşturma besiyeri olan MSgg katı besiyerinde 24, 48, 72 saat büyütülmüş, bacABCDEF operonunun ifade edildiği hücreleri tespit etmek amacıyla floresan mikroskobu altında incelenmişlerdir. Fakat floresan mikroskobu altında amyE::Pbac::gfp 3610 suşunun oluşturduğu biyofilm yapısından farklı zamanlarda ve farklı bölgelerden alınan örneklerde muhtemelen çok düşük Pbac-gfp ekspresyon seviyesi sebebiyle, Pbac-gfp füzyonunu ifade eden tekli hücreler tanımlanamamıştır. Bu ihtimalin doğrulanması için, bacA lokusunda (bacA::erm::lacZ) transkripsiyonel Pbac-lacZ füzyonu içeren B. subtilis 3610 suşu kullanılarak, basilisin operonunun ifade seviyesi β-galaktosidaz testi ile ölçülmüş ve tahmin edildiği gibi, laboratuar suşu PY79'a kıyasla, yabanıl suş 3610'da basilisin operonunun ifade seviyesinin yaklaşık 8 kat az olduğu bulunmuştur. Diğer taraftan, 24 ve 72 saat MSgg katı besiyerinde büyütülmüş hücrelere uygulanan akış sitometrisi analizinde olumlu sonuçlar elde edilmiş, floresan ifadesi görülen hücrelerin sırasıyla populasyonun %8.2 ve %2.22 oluşturduğu belirlenmiştir. Bu durumdan, 3610 suşunun biyofilm yapısında basilisin üretiminin küçük bir alt grup tarafından gerçekleştirildiği yani bimodal ekspresyon paterni gösterdiği anlaşılmıştır. Floresan mikroskobu altında biyofilm yapısındaki hangi hücre grubunda; hareketli, kısa çubuk şeklinde olan hücrelerde mi yoksa matriks üreticisi hareketsiz uzun hücre zincirlerinde mi basilisin üretiminin gerçekleştirildiğinin belirlenmesi için, matriks üretme özelliğini kaybetse bile 3610 gibi farklı hücre tiplerine farklılaşarak, heterojen populasyon oluşturabilen PY79 suşunda amyE::Pbac::gfp PY79 rekombinant suşu oluşturulmuştur. Daha önce tanımlandığı şekilde MSgg katı besiyerinde büyütülmüş, örnekler toplanıp analiz edilmiştir. 3610'da olduğu gibi akış sitometrisi analizi, PY79 suşunda da Pbac-gfp füzyonunu ifade eden hücrelerin bimodal dağılım gösterdiğini ortaya koymuştur. 24 ve 72 saat büyütülmüş hücrelerde floresan raportör ifadesi görülenler sırasıyla popülasyonun % 50.3 ve % 63.8'ini oluşturduğunu göstermiş, mikroskobik gözlemlerde bu sonucu desteklemiştir. Küçük çubuk şekilli hareketli hücrelerde ışıma düşük olmasına ya da hiç görülmemesine rağmen hücre toplulukları ve uzun zincirler oluşturup birbirlerine tutunan hareketsiz hücrelerde daha güçlü ışıma gözlemlenmiştir. Bu durum, basilisinin biyofilm yapısında matris oluşturan hücreler tarafından üretiliyor olabileceğini ortaya çıkarmıştır.

Özet (Çeviri)

Biofilm is defined as clusters of microbial cells that are surrounded by extracellular polymeric substances (EPS), and irreversibly attached on a surface or to each other. Bacillus subtilis NCIB 3610 undomesticated strains form complex, thick biofilms with wrinkled structures. B. subtilis as a model organism is preferred in biofilm studies, because it's a well-known and non-pathogenic organism. Biofilm formation initiates with the expression of matrix genes in response to some external signals. At the beginning, cells are short, motile rods but as the biofilm develops, they form long chains of non-motile cells that adhere to each other and to the surface by secreting an extracellular matrix. During biofilm maturation process, genetically identical Bacillus subtilis cells express different genes and specialized into cell types that carry out different functions within the population. Therefore, mature biofilms contain multiple coexisting cell types which are spatially organized: long chains of nonmotile cells that are held together in bundles which produce an extracellular matrix, small rod shape flagellated motile cells and spores. Differenciation of B. subtilis population into various cell-types enhances by combination of Quorum Sensing (QS) signals and heterogeneity within the QS signaling networks. Bacilysin produced by Bacillus species is one of the simplest peptide antibiotics that composed of an L-alanine residue at the N-terminus and a non-proteinogenic L-anticapsin at the C-terminus. The polycistronic bacABCDEF operon (formerly ywfBCDEFG), the monocistronic bacG (ywfH) gene are responsible for bacilysin biosynthesis. The production of bacilysin is controlled by ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA mediated by quorum sensing system and also by Spo0K (Opp). The comparative transcriptome analysis of B. Subtilis PY79 and its bacilysin non-producer derivative strain in bacilysin production medium performed by our research group strongly suggested that bacilysin plays important roles in sporulation, biofilm formation, competence development. Under normal condition, NCIB 3610 strain cannot form biofilm in LB medium. But, it was observed that 3610 strain can produce a thin layer biofilm in LB medium upon supplementing with bacilysin. B. subtilis QS molecule ComX and the lipopeptide antibiotic surfactin encoding by srfA operon in B. subtilis were shown to be required for bacilysin biosynthesis by our research group. Recently, surfactin was shown to be another QS molecule triggering a subpopulation of B. subtilis cells to become extracellular matrix producers. Interestingly, ComX QS molecule triggers only a subpopulation of cells to produce surfactin, in turn, surfactin causes another subpopulation of cells to produce an extracellular matrix. All of those findings not only strengthened the regulatory role of bacilysin in the biofilm formation process, but also strongly suggested that bacilysin, like surfactin, could be another QS molecule triggering cells to differentiate into distinct cell-type within a developing biofilm. To obtain initial evidences about this possibility, the present study was designed to elucidate whether bacilysin is produced by subpopulation of cells. For this, a transcriptional fusion with the open reading region encoding the green fluorescent protein (GFP) and the promoter region (Pbac) of the bacABCDEF operon was constructed in 3610 to identify individual cells producing bacilysin in biofilm structure. The resulting recombinant strain, amyE::Pbac::gfp 3610 was, then grown on biofilm-inducing minimal medium MSgg agar for 24, 48, 72 h. Samples were taken from 3 different regions in the biofilm structure on MSgg agar dependent on spatiotemporal organization, and observed under bright-field and fluorescence microscope comparatively to detect cells expressing Pbac-gfp. But, distinct fluorescent cells could not identified in the amyE::Pbac::gfp 3610 cells with direct fluorescence microscopy, most probably, due to very faint expression level of Pbac-gfp in 3610 cells. In order to check the expression level of bacilysin operon, β-galactosidase assay was performed with B. subtilis 3610 strain containing a transcriptional Pbac-lacZ fusion at bacA locus (bacA::erm::lacZ). It was found that, expression level of bacilysin operon was about 8 fold reduced in 3610 cells compared to the domesticated laboratory strain PY79 cells. Furthermore, flow cytometry analysis performed with the cells harvested after 24 h and 72 h growth on biofilm-inducing medium showed a subpopulation of 8.2% and 2.22% of the cells expressing the reporter for bacilysin operon at 24 h and 72 h of growth, respectively. B. subtilis PY79 strain keeps the ability to proliferate into heterogeneous population existing in morphologically distinct cell-types like 3610 even it lost the ability to produce extracellular matrix. Therefore, amyE::Pbac::gfp PY79 recombinant strain was immediately contructed and grown on MSgg agar to identify individual cells producing bacilysin under biofilm condition. The samples were collected and analysed as described before. Flow cytometry analysis demonstrated that like 3610 cells, distribution of PY79 cells expressing fluorescence was bimodal with most cells exhibiting little or no expression of the Pbac-directed gfp and a subpopulation of %50.3 and %63.8 of the cells exhibiting fluorescence at 24 h and 72 h growth, respectively. Direct microscopic observation of the PY79 cells supported the flow cytometry results. Small rod shape motile cells and single individiul cells exhibited little or no fluorescence, but stronger fluorescence was detected only in the cells aggregated and clumped together and in long chains of nonmotile cells that formed bundles which constitute matrix producing cells in a biofilm community, revealing that bacilysin could be produced by a small subset of matrix producing cells in B. subtilis biofilm structure.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    338378

    Proteome-wide analysis of the role of expression of bacilysin operon on idiophase physiology of B. subtilis

    Basilisin operonu ekspresyonunun B. subtilis'in idyofaz fizyolojisi üzerindeki görevinin proteom ölçekli analizi

    MUSTAFA DEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

  2. Tez No

    166407

    Identification of new genes related with bacilysin biosynthesis by Tn-10 mutagenesis method in Bacillus subtilis

    Basillus subtilis'te bacilysin biyosentezi ile ilgili yeni genlerin Tn-10 transpozon mutajenez metodu ile tanımlanması

    TÜRKAN EBRU AYDOĞDU KÖROĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2005

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    YRD. DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  3. Tez No

    269048

    Proteome-wide analysis of functional roles of bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilis

    Bacillus subtilis?de basilisin biyosentezinin fonksiyonel rolünün proteom ölçekli analizi

    ASLI ARAS TAŞKIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Bölümü

    PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

  4. Tez No

    292183

    Identification of AbrB and Spo0A binding sites on B. subtilis yvfI promoter

    AbrB ve Spo0A transkripsiyon faktörlerinin B. subtilis yvfI promotorundaki bağlanma bölgelerinin bulunmasi

    HÜSEYİN TAYRAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  5. Tez No

    583454

    Biological network modelling based on differentially expressed proteins in a bacilysin-deficient strain of Bacillus subtilis

    Bacillus subtilis'in basilisin üretemeyen bir suşunda farklı ifade gösteren proteinlere dayalı biyolojik ağ modellemesi

    MELTEM KUTNU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    GenetikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLAY ÖZCENGİZ

    DOÇ. DR. NURCAN TUNÇBAĞ

Geri Dön