Geri Dön

Development of a selection protocol for target nucleic acids based on nanoparticles

Nükleik asit hedeflerinde nanopartikul tabanlı seçim protokolü geliştirilmesi

  1. Tez No: 866029
  2. Yazar: AYŞE PINAR AKALIN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 83

Özet

Viral enfeksiyonlarda hızlı tanı ve tedavi hastaneye yatış ve komplikasyon risklerinin azaltılması açısından kritik öneme sahiptir. Bu amaçla, pahalı laboratuvar ekipmanlarının kullanımı ve uzman teknisyenler tarafından uygulama gerektirmeyen, sahada kullanılabilen ve taşınabilir çeşitli kişisel cihaz ve test kitleri geliştirilmiştir. Bu hızlı test cihazlarından yanal akış (Lateral flow/LF) prensibiyle çalışan testler yakın geçmişte karşılaştığımız COVID-19 pandemisiyle mücadelede, hastalığın yayılmasını önlemek amacıyla enfekte bireylerin izole edilmesinde çok önemli bir rol oynamıştır. Yanal akış testi temelde numunenin idrar, kan, tükürük, ter, serum veya diğer sıvılar olabileceği immünokromatografi yöntemiyle çalışan bir biyosensördür. Numunenin bir damlasını dedektöre yönlendiren ve proteinleri yakalayan, kullanıcının genellikle kasette bulunan bir test çizgisini ve bir kontrol çizgisini görmesine olanak tanıyan, örtüşecek şekilde üst üste yerleştirilmiş membranlardan oluşan bir şeritten oluşur. Testin kullanımı kolay, hızlı ve ucuzdur. Bu avantajlara rağmen, yanal akış immünoloji testlerinin özgüllüğü ve duyarlılığı sınırlıdır. pH, sıcaklık gibi çevresel koşullar veya iyonik etkileşimleri etkileyebilecek tuzlar nedeniyle kolayca değişebilen proteinlerin yapısı ve kararsızlığı, hassasiyet sorunlarına yol açmaktadır. Dahası, kullanılan antikorların saflaştırmasında olası sorunler nedeniyle testin özgüllüğü etkilenebilir ve bu durum hatalı pozitif ve negatiflere yol açabilir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve ABD Hastalık Kontrol Merkezi'ne (CDC) göre, nükleik asitlerin kullanımı moleküler biyolojide altın standarttır. Stabil ve çoğaltılabilir oldukları ve bu nedenle çok düşük konsantrasyonlarda tespit edilebildikleri için moleküler biyosensörlerdeki proteinlere tanısal ve daha iyi bir alternatiftir. Test hattı sinyalinin seviyesi konsantrasyonla doğru orantılıdır, elektronik bir sensör cihazı kullanılarak niceliksel bir değer elde etmek de mümkündür. Birçok çalışma, yanal akış analizlerinde proteinler yerine nükleik asitlerin kullanıldığını bildirdi. Ancak ticari tarafta kayda değer bir ilerleme ya da yaygın bir uygulama sağlanamadı. Olası sebeplerden biri, test geliştirmenin emek yoğun bir çalışma olması, bir diğeri amplifikasyon için cihaz gereksinimi olması ve bu da temelde yöntemin laboratuvar dışında uygulanabilmesini kısıtlamasıdır. Nükleik asit yanal akış testlerini gerçekleştirmek için iki yöntem vardır: NALF ve nükleik asit yanal akış immünokromatografi analizi (NALFIA). NALF, immünoloji reaktifleri içermez ve yalnızca Watson-Crick baz eşleşmesinin hibridizasyon kinetiğine dayanır. PCR reaksiyonundan elde edilen amplikon, altın (Au) ile konjuge edilmiş komplementer oligonükleotid fragmanları tarafından doğrudan tespit edilir ve önceden nitroselüloz membran üzerinde sabitlenmiş biotin-streptavidin gibi yüksek afiniteli muadili tarafından yakalanır. Hibridizasyon kağıt üzerinde meydana geldiğinden, üç parçadan herhangi birinde ikincil bir yapının oluşması, etkileşim dengelerinin ciddi şekilde bozulmasına neden olur ve yakalama istikrarlı bir şekilde gerçekleşmez, ayrıca testi geliştirirken de her yeni hedef için uzun optimizasyon çalışmaları yapılması gerekir. NALFIA ise tespit ve yakalama için belirlenmiş afiniteye sahip molekülleri kullanır. Numunede hedef nükleik asit mevcut ise, halihazırda amplifiye edilmiş etiketli ürün, nitroselüloz membran üzerindeki güçlü alıcı bağlayıcısı tarafından kolaylıkla tespit edilir ve yakalanır. Yapılandırması sırasında, optimizasyon çalışmaları da daha kolay yapılabilir ve her test türü için kullanılan reaktiflerin hedefe özel olması gerekmez. Kullanıcı tarafına bakıldığında, diğer nükleik asit amplifikasyon bazlı testler (NAAT) gibi nükleik asit yanal akış testleri klinik numuneleri analiz etmek için birkaç adım gerektirir: 1) hedef patojenin numuneden izolasyonu ve nükleik asitlerinin (NA) serbest bırakılması için hücre duvarının parçalanması (örneğin, burun sürüntüsünden virüs RNA'sı veya kandan bakteri DNA'sının çıkarılması); 2) NA'ların amplifikasyonu (çoğaltılması); 3) Hedef patojenin tespiti ve kontrol numunesiyle doğrulanması. Nükleik asit testlerinin yaygın olarak kullanılabilmeleri için bu adımların mümkün olduğunca azaltılması ve pratikleştirilmesi gerekir. Bu çalışma, SARS-CoV-2 ve influenza tespiti için NALFIA yöntemiyle geliştirilmiş multipleks bir ters transkripsiyon LAMP testi içermektedir. SARS-CoV-2 ve influenza-A RNA'larının aynı tüpte multipleks reaksiyon olarak spesifik ve izotermal amplifikasyonu için hedefe özgü (spesifik) ve verimli bir şekilde amplifikasyonu teşvik eden iki set altı primer ile başarıyla uygulanmıştır. Numunenin alınması, virüs lizizi, nükleik asit amplifikasyonu ve yanal akış tespitini içeren pratik bir iş akışı, yalnızca 30 dakika içinde sonuca ulaşılmasını sağlamıştır. Çalışmada NALFIA'nın moleküler tanıda PCR sonrası alternatif bir analiz yöntemi olarak pratik kullanımını yaygınlaştıracak evrensel bir tasarım da tanımlanmıştır. Çalışmada ayrıca manyetit (Fe3O4) veya maghemitten (γ-Fe2O3) oluşan manyetik nanopartiküllerin, (MNP'ler), biyomedikal uygulamalarda benzersiz özelliklerinden faydalanarak biyoayrım ve hızlı tanıda kullanım dinamikleri incelenmiştir. Manyetik parçacıklar, terminal işlevselleştirilmiş gruplara sahip polimerler, silika veya hidroksiapatitten oluşan bir kaplama matrisine sahip bir veya daha fazla manyetik çekirdekten oluşur. Biyolojik malzemeler manyetik katılar üzerinde immobilize edilebilir ve moleküler teşhiste biyosensör platformlarında kullanılabilir. Bu tür minyatür çip konfigürasyonlarında algılama sınırı (LOD) diğer yöntemlere göre daha fazla düşürülebilir. DNA tespiti ve kantitasyonunda, manyetik nanopartiküllere dayanan teknikler oldukça seçici ekstraksiyon sağlar ve düşük LOD'ler gösterir, bu da onları hibridizasyon ve sıralama için faydalı kılar. Ayrıca MNP tabanlı elektrokimyasal sensörler yüksek hassasiyetleri ve kararlılıkları nedeniyle biyomedikal uygulamalarda büyük ilgi görmüştür. Genellikle spesifik ligandlarla kaplanmış manyetik nanopartiküller, bir karışımdan nükleik asitleri seçici olarak yakalamak için kullanılabilir. Nanopartiküller daha sonra bir manyetik alan kullanılarak ayrılır ve istenen nükleik asitlerin seçici olarak tanımlanması için takip eden uygulamalara imkan sağlar. Manyetik nanopartiküller, reaksiyon için bir yüzey sağlayarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi nükleik asit amplifikasyon süreçlerini kolaylaştırabilir dolayısıyla reaksiyon verimliliğini artırarak test süresini kısaltabilir. Partiküle bağlı nükleik asitlerin özelliklerinin anlaşılması, hızlı teşhise yönelik biyosensör cihazlarının geliştirilmesi ve iyileştirilmesi açısından çok önemlidir. Çalışmada, aralayıcılı (spacer) ve doğrudan DNA oligonükleotidleri kullanılarak DNA bağlanan ve bağlanmayan manyetik nanopartiküller, spektroskopik (UV-Vis), morfolojik (AFM ve SEM) ve elektrokimyasal (elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) yöntemleriyle incelenmiştir. Manyetik olarak ayrıştırılan oligonükleotidlerin miktarının saptanmasında 260 nm tepe noktası 520 nm'de demir oksit tarafından korunup baskılanması nedeniyle UV/Vis ölçümlerinden sonuç alınamamıştır. Bununla birlikte konsantrasyon, bağlı DNA varlığı, DNA uzunluğu, empedans, kapasitans, UV emilimi ve parçacık boyutu gibi parametrelerin etkileri ölçülmüştür. Elektrokimyasal olarak bağlı ve bağlı olmayan MNP DNA'nın konsantrasyonu ve miktarı arasında açık bir korelasyon vardır ve bu, biyosensör verilerinin yorumlanmasında büyük fayda sağlayabilir. Çalışma stabilite, duyarlılık ve özgüllük açısından nükleik asitlerin kullanımını desteklemektedir. Nitekim, alınan sonuçlar grubun bir diğer projesinde biyoajanların tanısı için kullanılmaya uygun bir biyosensörün geliştirilmesine ışık tutmuştur. Geliştirilen biyosensör prensibi, poliantranilik asit (PANA) ve poliüretan (PU) karışımı içeren nanofiber yüzeye kovalent olarak bağlanan oligonükleotit probların immobilize edilerek hedef DNA dizilerinin hibridizasyonu temeline dayanmaktadır. Çalışmadan alınan hassas sonuçların tıbbi tanıda veya gıda güvenliğinde kullanılabilir, ekonomik ve pratik bir biyosensör üretimine fayda sağlayacağı gösterilmiş; buluş için ulusal patent alınmıştır.

Özet (Çeviri)

Early detection and treatment are critical for viral infections to reduce hospitalizations and the risk of complications. A wide range of point-of-care tests (POCTs) was developed for use as portable, handheld devices and test kits for performing diagnostic tests outside of a laboratory, some of which are not yet mature. In the fight against the recent pandemic COVID-19, lateral flow (LF) tests played a very important role in isolating infected individuals to prevent the spread of the disease. A lateral flow test is essentially an immunochromatography-based biosensor where sample may be urine, blood, saliva, sweat, serum, or other fluids. It consists of a strip of overlapping membranes that direct a drop of the sample onto the detector and capture proteins, allowing the user to see a test line and a control line, usually contained in a cassette. The test is easy to use, fast and inexpensive. Despite these advantages, there are limitations to the specificity and sensitivity of lateral flow immunoassay tests. The instability of the proteins, which can be easily altered by environmental conditions such as pH, temperature, or salts that can affect ionic interactions, leads to problems with sensitivity. Then, specificity is compromised by numerous interferences with native antibodies leading to false positives and negatives.. According to the World Health Organization (WHO) and the U.S. Center for Disease Control (CDC), the use of nucleic acids is the gold standard in molecular diagnostics and a better alternative to proteins in molecular biosensors because they are stable and amplifiable and therefore can be detected at very low concentrations. The level of the test line signal is directly proportional to the concentration, and it is even possible to obtain a quantitative value using an electronic sensor device. Many studies reported the use of nucleic acids instead of proteins in lateral flow assays. However, there was no significant progress or widespread application in practice. One of the reasons is the high labor intensity of assay development. There are two methods for performing nucleic acid lateral flow assays: NALF and nucleic acid lateral flow immunoassay (NALFIA). NALF contains no immunoreagents and is based solely on the hybridization kinetics of Watson-Crick base pairing. The amplicon from the PCR reaction, as a sample, is directly detected and captured by complementary oligonucleotide fragments conjugated to gold for detection and immobilized on the nitrocellulose membrane by a small molecule and its high affinity counterpart, such as biotin-streptavidin. Because hybridization occurs on paper, any formation of a secondary structure in any of the three fragments results in severe destabilization of the interactions and requires lengthy optimization for each new target. NALFIA, on the other hand, uses the molecules with established affinity for detection and capturing. Moreover, in the presence of the target nucleic acid region, the already amplified product with label is easily detected and captured by its strong acceptor binder on the nitrocellulose membrane. The architecture does not require specific optimization of the lateral flow strip, and the reagents used on the strip do not need to be target- specific. On the user side, nucleic acid lateral flow assays, like other nucleic acid amplification-based assays (NAAT), require several steps to analyze clinical samples. The three steps 1) isolation of the target pathogen from the sample and cell wall lysis to release its nucleic acids (NA) (e.g., RNA of virus from nasal swab or DNA of bacteria from blood); 2) amplification of NAs; 3) detection of the target pathogen and control. It is imperative to simplify and reduce these steps to expand their practical use. In this study, the development of a multiplex LAMP with reverse transcription in combination with a NALFIA for the detection of SARS-CoV-2 and influenza was reported. Two sets of six primers for the specific and isothermal amplification of SARS-CoV-2 and influenza-A RNA as a multiplex reaction in the same tube was successfully used. A practical workflow that includes sample collection, virus lysis, nucleic acid amplification and lateral flow detection has led to a result in just 30 minutes. The study also includes the description of a universal design for NALFIA that could facilitate its wider application for use as an alternative post-PCR analysis tool in diagnostics.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    388650

    Nükleik aside dayalı elektrokimyasal biyosensörler ile hibridizasyon algılanmasına ait yöntemlerin geliştirilmesi ve uygulanması

    Development and applications of hybridization detection methods with nucleic acide based electrochemical biosensors.

    SEDA NUR TOPKAYA

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    Eczacılık ve FarmakolojiEge Üniversitesi

    Analitik Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET EMİN ŞENGÜN ÖZSÖZ

  2. Tez No

    888707

    Patojenlerin tayini için nanomalzeme modifiye elektrokimyasal biyosensörlerin geliştirilmesi ve uygulaması

    Development and application of nanomaterial-modified electrochemical biosensors for the detection of pathogens

    HÜSEYİN OĞUZHAN KAYA

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Eczacılık ve FarmakolojiEge Üniversitesi

    Analitik Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HAKAN KARADENİZ

    PROF. DR. SEDA NUR TOPKAYA ÇETİN

  3. Tez No

    55498

    Bağ gerçek zamanlı dağıtılmış sisteminde görev göç ettirme ve yük dengeleme

    Başlık çevirisi yok

    ERSOY PEKŞEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1996

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolAkdeniz Üniversitesi

    Y.DOÇ.DR. B. TEVFİK AKGÜN

  4. Tez No

    518096

    Elektronik tekstil tabanlı romatoid artrit rehabilitasyon eldiveni geliştirilmesi

    Development of a e-textile rheumotoid arthritis glove for rehabilitation

    NEŞE TOPCUOĞLU GÜRAY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Endüstri Ürünleri Tasarımıİstanbul Teknik Üniversitesi

    Tekstil Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. GÖZDE GÖNCÜ BERK

  5. Tez No

    683923

    Development of insect resistant transplastomic potato lines against colorado potato beetle (Leptinotersa decemlineata)

    Kolorado patates böceğine (Leptinotarsa decemlineata) karşı böceklere dayanıklı transplastomik patates hatları gelıştırılmessı

    MD JAKIR HOSSAIN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    ZiraatNiğde Ömer Halisdemir Üniversitesi

    Tarımsal Genetik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. ALLAH BAKHSH

Geri Dön