Investigation of the effects of abrb and cody deletions on the bacilysin overproducer B. subtilis HWA strain
AbrB ve CodY yokluğunun basilisin yüksek üreticisi B. subtilis HWA suşundaki etkilerinin incelenmesi
- Tez No: 888636
- Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Genetics, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 85
Özet
Bacillus subtilis gram pozitif, çubuk şeklinde bir toprak bakterisi ve çokça çalışılmış bir model organizmadır. Çevresel koşullara göre düzenlenen adapte olabilir bir metabolizmaya ve çeşitli fizyolojik hallere sahiptir. B. subtilis türleri sporülasyon ile yüksek sıcaklık ve UV radyasyonu gibi ağır çevresel koşullarda hayatta kalabilen endosporlar oluştururlar. Ayrıca biyofilm oluşturma, bitki köklerine veya fungal hiflere tutunma, doğal kompetentlikleri sayesinde dışarıdan DNA alma, yüzey motilitesi ve ikincil metabolitleri üretme ve salgılama özelliklerine sahiptirler. B. subtilis genomunun yaklaşık %4-5'i ikincil metabolitleri kodlamaktadır. B. subtilis tarafından üretilen ikincil metabolitler ilaç, tarım, hayvancılık ve tekstil endüstrilerinde kullanılmaktadır. Bu ikincil metabolitlerden bir tanesi, bu çalışmanın ana odağı olan basilisin molekülüdür. Basilisin ribozom dışı sentezlenen, protein kökenli olmayan amino asit L-antikapsin ve L-alaninin birleşmesiyle oluşturulan bir dipeptit antibiyotiktir. Basilisin geniş spektrumlu bir antibiyotik olmasına ek olarak küçük yapısıyla da ilgi çekmektedir. Basilisin bazıları patojenik olan çeşitli bakteri, mantar ve alg türlerinde seçici hücre duvarı yıkımına sebep olmaktadır. Basilisini oluşturan amino asitlerden L-alanin basilisinin hücre içiresine transferini kolaylaştırırken L-antikapsin hücre duvarı yıkımına sebep olmaktadır. Hedef hücrelerin içerisine alınmasının ardından basilisinin çeşitli peptidazlar tarafından hidroliz edilmesiyle yapısındaki antikapsin serbest kalarak glukozamin-6-fosfat sentetaz enzimini inhibe etmektedir. Glukozamin-6-fosfat sentetaz enziminin inhibasyonu hücre duvarı sentezini durdurarak hücre ölümüne sebep olmaktadır. Bu özelliği sayesinde basilisin ve basilisin üreten B. subtilis suşları birer biyokontrol ajanı adayı haline gelmiştir. Basilisin, B. subtilis hücrelerinde sporülasyon, germinasyon ve vejetatif hücre formuna geçiş süreçlerinde etkili pleitropik bir sinyal molekülüdür. Yapılan çalışmalar basilisin yokluğunun spor kalitesi ve germinasyon üzerinde negatif etkileri olduğunu göstermiştir. Basilisin üretemeyen suşun sıcaklığa, kimyasallara ve lizozime karşı daha yüksek hassasiyet gösterdiği gözlemlenmiş, ek olarak B. subtilis PY79 ve bacilysin üretmeyen suş ile yapılan karşılaştırılmalı transkriptom analizi kompetent gelişimi ve biyofilm oluşumu ile ilgili pek çok genin de basilisin yokluğundan etkilendiği belirlenmiştir. B. subtilis'te bacABCDEF operonu ve komşu tekli gen bacG basilisin biyosentezinden sorumludur. bacABCDFG genleri L-antikapsinin sentezlenmesi ve L-alanin ile ligasyonunda görev alarak basilisin biyosentezini gerçekleştirirken bacE geni biyosentezi tamamlanan basilisinin hücre dışına transferini sağlayarak üretici olan B. subtilis hücrelerinin korunmasından sorumludur. Basilisin üretimi hem iç hem dış faktörlere göre düzenlenmektedir. Yapılan çalışmalar besi yeri içeriği, sıcaklık, pH gibi büyüme koşullarının basilisin üretimi seviyesini etkilediğini göstermiştir. Transkripsiyonel seviyede basilisin biyosentezi iki ana mekanizma ile düzenlenmektedir. Bu mekanizmalar quorum sensing yolağı ve stringent response olarak adlandırılmaktadır. Basilisin biyosentezinin kontrolü pozitif düzenleyiciler olan ComA~P, Spo0A~P, ve LutR molekülleri ve negatif düzenleyiciler olan AbrB, CodY ve ScoC moleküllerinin direkt görev aldığı gösterilmiştir. Bu düzenleme mekanizmalarına ek olarak basilisinin kendi biyosentezini geribildirim (feedback) mekanizması ile kontrol ettiği gösterilmiştir. Yapılan çalışmada besi ortamına basilin ilavesinin basilisin üretimi üzerinde baskılayıcı etki gösterdiği, basilisin ilavesinin daha erken fazda eklenmesinin daha yüksek baskılayıcı etkiye sebep olduğu belirlenmiştir. Basilisinin geniş spektrumlu bir antibiyotik olması, 100°C de 15 dakikaya kadar stabil kalabilmesi ve pH 1.4 ve 12.0 aralığında aktif olması gibi özellikleri basilisinin klinik açıdan önemini arttırmakta ve geleneksel ilaçlar ve biyokontrol ajanları yerine kullanılabilecek etkili bir alternatif haline getirmektedir. Fakat basilisinin düşük seviyelerde üretimi, organik çözücüler kullanılarak izole edilebilmesi ve izolasyon veriminin düşüklüğü basilisinin ticari bir ürün haline gelmesine engel olmaktadır. Daha önce laboratuvarımızda basilisin biyosentezini artırmak amacı ile 5' UTR bölgesine CRISPR/Cas9 yaklaşımı ile uyguladığımız genom düzenleme uygulamaları neticesinde, 2.87 kat daha fazla basilisin üreten, yüksek basilisin üretici suşu HWA elde edilmiştir. Bu çalışmayı takiben, bu tez çalışmasında B. subtilis HWA suşunda basilisin üretiminin daha da arttırılması hedeflenerek, global düzenleyiciler AbrB ve CodY yokluğunun basilisin üretimi üzerindeki etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca ulaşmak için B. subtilis PY79-GT0A (ΔabrB::cat) ve B. subtilis PY79-GT0C (unkU::spc ΔcodY) mutant suşları; kompetent PY79 hücrelerinin sırasıyla abrB silinmiş B. subtilis BAL 373 (trpC2 pheA1 ΔabrB::cat) mutant suş ve codY silinmiş B. subtilis TMH 307 (trpC2 unkU::spc ΔcodY) mutant suşundan izole edilmiş kromozomal DNA ile transformasyonu sonucu oluşturulmuştur. Benzer şekilde B. subtilis HWA-GTA (ΔabrB::cat) ve B. subtilis HWA-GTC (unkU::spc ΔcodY) mutant suşları kompetent HWA hücrelerinin transformasyonu ile oluşturulmuştur. Sonrasında codY-abrB çifte mutant suşları B. subtilis PY79-GT0AC (ΔabrB::cat unkU::spc ΔcodY) ve B. subtilis HWA-GTAC (ΔabrB::cat unkU::spc ΔcodY); kompetent HWA-GTA ve PY79-GT0A hücrelerinin sırasıyla HWA-GTC ve PY79-GT0C mutant suşlarından izole edilmiş kromozomal DNA ile transformasyonu sonucu oluşturulmuştur. Olası triptofan ve/veya fenilalanin oksotrofisine sahip mutantlar, Spizizen Minimal besiyeri üzerine çizilerek elenmiştir. Seçilen mutantların basilisin fenotipi öncelikle Staphylococcus aureus ATCC 9144 içeren katı besi yerine çizilerek tespit edilmiş, sonrasında mutantlar PA besi yerinde 16-18 saat büyütülüp kültür sıvısınlarındaki basilisin seviyeleri disk difüzyon yduyarlıöntemiyle belirlenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları HWA ve PY79 hücrelerinde abrB yokluğunun basilisin üretimini önemli ölçüde arttırdığını, fakat bu artışın iki suş için farklı oranlarda olduğunu göstermiştir. Basilisin üretimi HWA-GTA suşunda atası olan HWA suşundaki basilisin üretimine kıyasla %7.7 oranında artış gösterirken, PY79-GT0A suşunda atası olan PY79 suşundaki basilisin üretimine kıyasla %21.8 oranında artış göstermiştir. İlginçtir ki AbrB mutantı olan suşlara codY mutasyonunun eklenmesi her iki suşta da basilisin üretimini HWA ve HWA-GTA suşlarına kıyasla sırasıyla %22.1 ve %13.4 oranlarında, PY79 ve PY79-GT0A suşlarına kıyasla sırasıyla %25.7 ve %3.2 oranlarında daha da arttırırken, codY mutasyonu basilisin üretiminde tek başına önemli ölçüde bir etkiye sahip olamamıştır. Son olarak basilisin üretimini daha da arttırmak amacıyla bac operonunun bir diğer negatif düzenleyicisi olan scoC mutasyonu abrB-codY çifte mutant suşlara eklenmiştir. Ancak elde edilen üçlü mutant suş sıvı besi yerinde büyüyememiş ve bu üç global düzenleyici molekülün aynı anda ortadan kaldırılmasının büyüme becerisini ciddi derecede etkilediğini göstermiştir. Özetle, basilisin biyosentezinin iki önemli negatif düzenleyicisi olan AbrB ve CodY moleküllerinin eş zamanlı inaktivasyonunun basilisin üretimini, basilisin yüksek üreticisi olan HWA suşunda bile, daha da arttırabileceği gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
Bacillus subtilis is a gram-positive, rod-shaped bacterium and a highly studied model organism. It has a highly adaptable metabolism and diverse physiological states regulated according to environmental conditions. B. subtilis species go through sporulation to form endospores that can survive harsh conditions such as high temperatures, and UV radiation. They can also form biofilms, attach to plant roots or fungal hyphae, take up extracellular DNA by its natural competence, show surface motility, produce and secrete secondary metabolites. Approximately 4-5% of the B. subtilis genome codes for secondary metabolites, including antibiotic bacilysin. Bacilysin, the main focus of this study, is a non-ribosomal dipeptide by linking non-proteinogenic amino acid anticapsin and L-alanine. Bacilysin causes selective cell wall disruption against bacteria, fungi, and algae species, some of which are pathogenic. Bacilysin is a pleiotropic signaling molecule for B. subtilis cells as it affects diverse cellular functions such as sporulation, germination and outgrowth. Previous studies have shown that the absence of bacilysin can have negative effects on spore quality and germination. A bacilysin non-producer strain was more sensitive to heat, chemicals and lysozyme. Additionally, comparative transcriptome analysis of B. subtilis PY79 and a bacilysin non-producer strain revealed that some genes related to competence development and biofilm formation are also affected by bacilysin. In B. subtilis, bacilysin biosynthesis relies on the expression of the bacABCDEF operon and a monocistronic gene bacG. Bacilysin production is regulated according to both external and internal factors. It has been established that growth conditions such as medium contents, temperature, and pH affect bacilysin production level. At the transcriptional level, bacilysin biosynthesis is regulated mainly via two mechanisms: quorum sensing pathway and stringent response that occur through the direct-action of the positive transcriptional regulators, including ComA~P, Spo0A~P, and LutR as well as negative transcriptional regulators AbrB, CodY, and ScoC. Bacilysin has broad-range activity against bacteria, with heat stability up to 15 min at 100°C, and activity within the pH range of 1.4 to 12.0. These characteristics give bacilysin significant clinical importance and make it an effective alternative to traditional drugs and biocontrol agents. However, bacilysin is produced at low levels, cannot be extracted with organic solvents, and has a low isolation yield. In our group, the bacilysin production level was increased at 2.87- fold via editing the 5' untranslated region (5'UTR) of the bac operon using the CRISPR/Cas9 approach, thereby obtaining the bacilysin overproducing strain B. subtilis HWA. Subsequently, to further boost the bacilysin production level in the over-producing strain B. subtilis HWA, the aim of this study was to examine how production levels are affected by eliminating the global regulators AbrB and CodY. To achieve this, the mutant strains B. subtilis PY79-GT0A (ΔabrB::cat) and B. subtilis PY79-GT0C (unkU::spc ΔcodY) were constructed by transforming competent PY79 cells with chromosomal DNA from the abrB deleted mutant strain B. subtilis BAL 373 (trpC2 pheA1 ΔabrB::cat) and the codY deleted mutant strain B. subtilis TMH 307 (trpC2 unkU::spc ΔcodY), respectively. Similarly, the mutant strains B. subtilis HWA HWA-GTA (ΔabrB::cat) and B. subtilis HWA-GTC (unkU::spc ΔcodY) were constructed by transforming competent HWA cells. Furthermore, the codY-abrB double mutant strains B. subtilis PY79-GT0AC (ΔabrB::cat unkU::spc ΔcodY) and B. subtilis HWA HWA-GTAC (ΔabrB::cat unkU::spc ΔcodY) were constructed by transforming competent cells of GT0A and GTA with chromosomal DNA from B. subtilis TMH 307. Potential tryptophan and/or phenylalanine auxotrophic mutants were eliminated by restreaking on solid Spizizen Minimal Media. Bacilysin phenotypes of the selected mutants were first detected by transferring colonies via toothpicks onto bioassay plates using Staphylococcus aureus ATCC 9144. Subsequently, mutants were grown in PA media for 16-18 hours and the bacilysin levels in their culture fluids were detected via paper disk-diffusion bioassay. Results showed that abrB disruption in HWA and PY79 cells significantly increased bacilysin production, though each strain was affected differently based on its baseline bacilysin production level. The bacilysin level in HWA-GTA increased by 7.7% relative to parental HWA strain, while PY79-GT0A displayed a 21.8% bacilysin level relative to its parent PY79. Interestingly, while codY mutation alone did not significantly affect bacilysin activity in HWA or PY79, adding codY mutation to AbrB mutants of both strains caused further increases of 22.1% and 13.4% relative to HWA and HWA-GTA, respectively, and 25.7% and 3.2% relative to PY79 and PY79-GT0A, respectively. In a final attempt to further enhance bacilysin production, the scoC mutation as an additional negative regulator of the bac operon was combined with the abrB-codY double mutation strain. However, the constructed triple mutant strain could not grow in liquid media, demonstrating that simultaneous disruption of these three global regulators severely compromised growth abilities of B. subtilis cells. In summary, the findings of this thesis study are important to revealing that concurrent inactivation of AbrB and CodY, two key negative regulators of bacilysin biosynthesis, provides the potential for improving bacilysin production levels further, even in the high-producing strain HWA.
Benzer Tezler
- Taşkömürünün yağ aglomerasyonu ile zenginleştirilmesinde bazı işletme parametrelerinin etkisinin incelenmesi
Investigation of the effects of some operating parameters with the benefication of oil agglomeration of hardcoals
SELMA ŞİMŞEK
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Maden Mühendisliği ve MadencilikCumhuriyet ÜniversitesiMaden Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YAKUP CEBECİ
- Yüksek karbonlu çeliklerin süperplastikliği üzerine alaşım elementlerinin etkisinin araştırılması
Investigation of the effects of alloying elements on the superplasticity of high carbon steels
BÜLENT KURT
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Eğitim ve ÖğretimFırat ÜniversitesiMetalurji Eğitimi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. M. MUSTAFA YILDIRIM
- Titanyum dioksitin fare ince bağırsak mukoza epiteli hücrelerine etkilerinin elektron mikroskopla incelenmesi
Investigation of the effects of titanium dioxide on the mucosa epithelial cells of small intestine of mice by electron misroscope
ABDULLAH MELEKOĞLU
- Bilyalı dövme parametrelerinin 1020 çeliğinin yorulma davranışına etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of shot peening parametres on the fatigue behaviour of 1020 steel
ŞENAY ORMAN
- Çeşitli dezenfektan ve antiseptiklerin bazı bakteri suşları üzerine olan etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of various disinfectants and antiseptics on some bacterial strains
EMİNE GÜL DELİBAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
1998
MikrobiyolojiÇukurova ÜniversitesiMikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YAHYA HAKGÜDENER