Toxoplasma gondii'ye karşı etkili mRNA aşısının tasarlanması ve geliştirilmesi
Design and development of effective mRNA vaccine against toxoplasma gondii
- Tez No: 890911
- Danışmanlar: DOÇ. DR. HÜSEYİN CAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Moleküler Tıp, Biotechnology, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Aşı Çalışmaları Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Aşı Çalışmaları Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 110
Özet
Toxoplasma gondii, insanlar yanında birçok hayvanıda enfekte ederek toksoplazmozise neden olan zorunlu hücre içi bir parazittir. Tüm dünyada insan nüfusunun yaklaşık üçte birinin T. gondii ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. T. gondii gebelerde düşük veya malformasyonlara sebep olabilirken immün sistemi baskılanmış hastalarda ensefalit, pnömoni veya miyokardit gibi hastalıklara sebep olabilir. Ayrıca yakın zamanda yapılan çalışmalarda, toksoplazmozis ile psikiyatrik hastalıklar arasında ilişki kurulmaktadır. T. gondii özellikle koyunlarda da aborta sebep olarak ciddi ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Hastalığa karşı kullanılan ilaçların ciddi yan etkileri bulunmakla birlikte kronik toksoplazmozise de etkisiz kalmaktadır. Bu gibi olumsuz etkilerin önüne geçebilmenin en etkili yollarından birisi aşılardır lakin insanların kullanımı için onay almış bir aşı henüz bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu tez kapsamında, T. gondii'ye karşı etkili mRNA aşı transkriptlerinin geliştirilmesi ve bu transkriptlerin in vitro ortamda ürettikleri rekombinant proteinin miktarının ve immunojenisitesinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, öncelikle T. gondii GRA1 proteini aşı antijeni olarak belirlenmiş ve in silico yöntemler ile GRA1 proteinin çözünürlüğü instabilite indeksi, stabilitesi, yarılanma ömrü ve antijenisitesi analiz edilmiştir. Sonrasında GRA1 geninin de dahil olduğu in vitro transkripsiyon (IVT) dizilerini taşıyan pEX-A258-GRA1 vektörü hizmet alımı ile temin edilmiştir. Bu adımı takiben, pEX-A258-GRA1 vektöründeki IVT dizisi, mRNA aşı transkriptlerinin üretimini sağlamak için pVAX1 vektörüne klonlanmış ve bu vektöre pVAX1-GRA1 adı verilmiştir. pVAX1-GRA1 lineerize edilerek IVT ile dört farklı tipte mRNA aşı transkripti üretilmiştir. mRNA aşı transkriptleri, N1-metil psödouridin (m1Ψ + 120 bp) veya vahşi tip uridin (üridin + 120 bp) ile üretilmiştir. Ayrıca bu iki mRNA aşı transkriptinin sonuna ~150 bp büyüklükte adenin bazı eklenerek iki farklı (m1Ψ + 120 bp + poli-A kuyruğu eklenmiş ve üridin + 120 bp + poli-A kuyruğu eklenmiş) mRNA transkript üretimi yapılmıştır. IVT ile üretilen mRNA aşı transkriptleri saflaştırılmış ve daha sonra HEK293T hücrelerine transfekte edilerek eksprese olan rekombinant GRA1 proteinin ekspresyon seviyesi ve immünojenisitesi IFAT, Western blot ve ELISA kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, transfeksiyondan 24 saat sonra hücre lizatları toplanarak Western blot ile protein ekspresyonu incelenmiş ve“üridin + 120 bp”mRNA aşı transkriptleri ile ekspresyonun en fazla olduğu, en az protein ekspresyonunun ise“m1Ψ + 120 bp + poli-A kuyruğu eklenmiş”mRNA aşı transkriptleri ile transfekte edilen hücrelerde görüldüğü belirlenmiştir. IFAT ve ELISA ile de bu sonuç doğrulanmış olup buna göre“üridin + 120 bp”mRNA aşı transkriptlerinin“m1Ψ + 120 bp”mRNA aşı transkriptlerine göre daha fazla protein ekspresyonu gerçekleştirdiği saptanmıştır. Buna ek olarak mRNA aşı transkriptlerine ~150 bp poli-A kuyruğu eklenmesinin protein ekspresyon seviyesini arttırmadığı belirlenmiştir. IVT ile üretilen 4 farklı mRNA aşı transkriptinin, HEK293T hücrelere transfeksiyonu sonrasında eksprese olan rekombinant GRA1 proteinin immünojenik olduğu T. gondii ile enfekte olan fare serumları kullanılarak Western blot ve ELISA ile belirlenmiştir. Sonuç olarak, mRNA aşı transkriptlerinin HEK293T hücre hattında başarılı bir şekilde rekombinant GRA1 proteini eksprese ettiği ve üretilen GRA1 proteinin immünojen olduğu belirlenmiştir. Dahası, vahşi tip uridin veya m1Ψ içeren mRNA aşı transkriptlerinin lipit nanopartikül içine alındıktan sonra potansiyel aşı adayı olarak kullanılabileceği düşünülmüştür.
Özet (Çeviri)
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that infects many animals besides humans, causing toxoplasmosis. It is estimated that approximately one-third of the human population in worldwide is infected with T. gondii. T. gondii can cause miscarriage or malformations in pregnant women, while it can cause diseases such as encephalitis, pneumonia or myocarditis in patients with suppressed immune systems. In addition, recent studies have established a relationship between toxoplasmosis and psychiatric diseases. T. gondii causes serious economic losses, especially in sheep, by causing abortion. Drugs used against the disease have serious side effects and are ineffective against chronic toxoplasmosis. One of the most effective ways to prevent such negative effects is vaccination, but there is no vaccine approved for human use yet. Therefore, within the scope of this thesis, it was aimed to develop effective mRNA vaccine transcripts against T. gondii and to determine the amount and immunogenicity of the recombinant protein which is produced with in vitro transcripts. For this purpose, firstly T. gondii GRA1 protein was determined as the vaccine antigen and the solubility instability index, stability, half-life and antigenicity of GRA1 protein were analyzed by in silico methods. Afterwards, the pEX-A258-GRA1 vector carrying in vitro transcription (IVT) sequences including the GRA1 gene was provided by service procurement. Following this step, the IVT sequence in the pEX-A258-GRA1 vector was cloned into the pVAX1 vector to enable the production of mRNA transcripts, and this vector was named pVAX1-GRA1. Four different types of mRNA vaccine transcripts were produced by IVT by linearizing pVAX1-GRA1. The mRNA vaccine transcripts were produced with a modified nucleoside, N1-methyl pseudouridine (m1Ψ + 120 bp) or wild-type uridine (uridine + 120 bp). In addition, by adding ~150 bp adenine bases to the end of these two mRNA vaccine transcripts, two more different ones (m1Ψ + 120 bp + poly-A tail added and uridine + 120 bp + poly-A tail added) were produced. IVT-produced mRNA vaccine transcripts were purified and then transfected into HEK293T cells, and the expression level and immunogenicity of the expressed recombinant GRA1 protein were determined using IFAT, Western blot and ELISA. According to the results obtained, cell lysates were collected 24 hours after transfection and protein expression was examined by Western blot and it was determined that the highest expression was seen with the“uridine + 120 bp”mRNA vaccine transcripts, while the lowest protein expression was seen in cells transfected with the“m1Ψ + 120 bp + poly-A tail added”mRNA vaccine transcripts. This result was confirmed by IFAT and ELISA, and it was determined that“uridine + 120 bp”mRNA vaccine transcripts expressed more protein than“m1Ψ + 120 bp”mRNA vaccine transcripts. In addition, it was determined that adding ~150 bp poly-A tail to mRNA vaccine transcripts did not increase protein expression levels. The immunogenicity of the recombinant GRA1 protein expressed after transfection of 4 different mRNA vaccine transcripts produced by IVT into HEK293T cells was determined by Western blot and ELISA using T. gondii infected mouse sera. In conclusion, mRNA vaccine transcripts were successfully expressed recombinant GRA1 protein in HEK293T cell line and the produced GRA1 protein was determined to be immunogenic. Moreover, mRNA vaccine transcripts containing wild type uridine or m1Ψ could be used as potential vaccine candidates after encapsulation into lipid nanoparticles.
Benzer Tezler
- Ginkgo biloba ekstraktının toxoplasma gondii'ye karşı ın vivo etkisi
In vivo activity of extracts of ginkgo biloba against toxoplasma gondii
SELCAN AKYOL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2014
Mikrobiyolojiİstanbul ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT HÖKELEK
- Toksoplazmoza karşı sentetik peptit bazlı subunit aşı formülasyonunun etkinliğinin ın vıvo çalışmalarda gösterilmesi
Demonstration of the effectiveness of synthetic peptide-based subunit vaccine formulation against toxoplasmosis in vivo studies
ESLİN ÜSTÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. RABİA ÇAKIR KOÇ
- Bitkisel ekstraktların (Nigella sativa, Zingiber officinale) tek başına ve primetamin-sülfadiazin ile birlikte kullanımının Toxoplasma gondii'ye karşı in vivo etkisi
In vivo effect of herbal extracts (Nigella sativa, Zingiber officinale) alone and combined with primethamine-sulfadiazine against toxoplasma gondii
NEVZAT ÜNAL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2012
MikrobiyolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT HÖKELEK
- Toxoplasma gondii'ye etkili ilaçların immünmodülatörlerle kombinasyonunun in vivo etkisi
In vivo activities of the antitoxoplasma drugs combined with immunmodulation agents on Toxoplasma gondii
ZEYNEP ŞENTÜRK KÖKSAL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2009
MikrobiyolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT HÖKELEK
- Toxoplasma gondii rekombinant ROP6 proteininin Saccharomyces cerevisiae INVSc.1 suşunda ekspresyonu ve saflaştırılması
Expression and purification of Toxoplasma gondii Recombinant ROP6 protein in saccharomyces cerevisiae INVSc.1 strain
TUĞBA KARAKAVUK
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyoteknolojiEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MERT DÖŞKAYA
DOÇ. DR. HÜSEYİN CAN