Molecular dynamics studies on proteins involved in genetic variation and metabolism: DMC1 and lipase
Genetik varyasyon ve metabolizmada rol alan proteinler üzerine moleküler dinamik çalişmalari: DMC1 ve lipaz
- Tez No: 917620
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ BÜLENT BALTA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 126
Özet
Homolog rekombinasyon ve lipazlar tarafından katalizlenen enzimatik süreçler, biyolojik sistemlerde önemli roller oynar ve bilim ile endüstride geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir. Homolog diziler arasında genetik materyalin transferi homolog rekombinasyon olarak adlandırılmaktadır. Homolog rekombinasyon, genetik çeşitliliğin oluşması açısından önemliyken, DNA onarımları genom bütünlüğünün sürdürülmesinde kritik rol oynamaktadır. Dmc1, mayoz rekombinasyon sırasında homolog rekombinasyona katılırken, Rad51, DNA onarım mekanizmasının işleyişi için gereklidir. Ökaryotlarda rekombinazlar bu şekilde iken arkelerdeki homolog enzim RadA, bakterilerdeki homolog enzim ise RecA olarak bilinmektedir. Homolog rekombinasyonun, homolog kromozomları eşleştirerek ve senkronize ederek DNA çift zincir kırıklarını (DSB) onardığı bilinmektedir. Ancak rekombinasyonun genetik çeşitliliği oluşturduğu ve rekombinasyonel onarımanın genom bütünlüğünü koruduğu durumlarından hangisinin önce evrildiği konusu hala tartışılmaktadır. Homolog rekombinasyon eksikliği (HRD) olarak adlandırılan bir biyolojik durum, hücrelerin homolog rekombinasyon yolunu kullanarak çift zincirli DNA kırıklarını onaramayacakları durumdur. BRCA1 ve BRCA2 genlerindeki mutasyonlar, homolog rekombinasyon onarım süreciyle yakından ilişkilidir. Dmc1 oktametrik halka konfigürasyonunda kristal yapılar oluşturduğu gösterilen birkaç yapıya sahiptir. Ayrıca, filament formunda kristalize olmuş yapıları da bulunmaktadır. Bu farklı yapılar, Dmc1'in yapısal esnekliğini ve DNA ile etkileşim mekanizmasını daha iyi anlamamızı sağlamaktadır. Yapılan deneysel çalışmalar da ATP ve DNA yokluğunda Dmc1'in oktamerik halka yapısında olduğunu göstermiştir. Tek zincir DNA (ssDNA) varlığında ise DNA üzerine istiflenmiş Dmc1 halkaları olarak gözlenmiştir. SsDNA ve ATP'nin birlikte varlığı sarmal filament oluşumunu sağlamaktadır. Çevre koşullarına bağlı olarak Dmc1 farklı konfigürasyonlarda görülebilmektedir. Dmc1'in aktif konfigürasyonunun Rad51'teki gibi sarmal filament olduğu da bilinmektedir. Bu çalışmada, insan Dmc1 proteininin farklı oligomerik durumları üzerinde moleküler dinamik simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın amacı, nükleotid bağlanması, protonlanma durumları ve peptit bağı izomerizasyonunun Dmc1 proteininin N- ve C-terminal bölgelerinin kararlılığı ve dinamik davranışları üzerindeki etkilerini ve ayrıca halka-filament geçişlerini incelemektir. Olası halka-sarmal geçişleri, bu geçişe ATP/ADP'nin etkisi veya fonksiyonel mekanizma hakkında henüz moleküler düzeyde bilgi yoktur. Dmc1 proteini, homolog rekombinasyonda yer almakta ve genetic çeşitlilikte önemli bir rol oynamaktadır. Dmc1 proteininin moleküler dinamiklerini inceleyen bu çalışma, Dmc1'in çeşitli koşullar altındaki davranışını ve etkileşimlerini anlamamıza yardımcı olan ayrıntılı bilgiler sunmaktadır. ATP'nin varlığı veya yokluğunun ve DNA varlığı veya yokluğunun Dmc1'nin davranışı üzerindeki etkisi incelenmiştir. ATP'nin ve nükleik asitlerin etkileşimi, Dmc1'nin aktif konformasyonunu belirlemede önemli bir rol oynadığı belirlenmiştir. R230, literatüre göre DNA ile etkileşim kurarak bu yapının stabilitesini sağlar. Bununla birlikte, elde edilen bulgular, R230'un DNA ile etkileşim kurmak yerine E162 ile etkileşim kurduğunu göstermiştir. Dmc1 proteininin aktif bölgesindeki yük dengesini belirlemek için termodinamik entegrasyon (TI) yöntemi kullanılarak pKa hesaplanmıştır. Hesaplamalar ATP ve Ca2+ varlığında ve yokluğunda, değişik büyüklükteki protein (monomer ve trimer) için yapılmıştır. E162 ve H295 amino asitleri için protonasyon durumları ve bu durumların DNA-Dmc1 kompleksinin stabilitesi üzerindeki etkileri detaylıca araştırılmıştır. E162'nin protonasyon durumu ile DNA bağlanma yeteneği arasında dikkate değer bir ilişki olduğu gözlenmiştir. Protonlanmış E162 içeren simülasyonlar, DNA bağlanmasını kolaylaştırırken, protonlanmamış E162 içeren yapılar DNA ile zayıf etkileşim kurmuştur. R230, DNA'ya bağlanmak yerine negatif yüklü E162 ile tuz köprüsü kurmayı tercih etmiştir. Bu sonuç, E162'nin protonasyon durumunun daha geniş etkilerini incelemek için araştırmamızı derinleştirmemizi sağlamıştır. Bu, özellikle homolog rekombinasyon gibi DNA ile doğru etkileşimlerin gerekli olduğu Dmc1 proteini işlevinin incelenmesi açısından önemlidir. Simülasyonlar kapsamında standart moleküler dinamik analizleri, pKa değerlerinin hesaplanması için termodinamik integrasyon ve serbest enerji profilini belirlemek için umbrella sampling yöntemleri kullanılmıştır. E162 ve H295 amino asitlerinin protonlanma durumları, D223-S224 peptit bağının cis-trans izomerizasyonu ve ATP, ADP veya nükleotid içermeyen bağlanma durumları sistematik olarak incelenmiştir. Root Mean Square (RMSD) analizleri, C-terminal bölgenin dengeye ulaştığını, ancak N-terminal bölgenin hareketli olduğunu ortaya koymuştur. Yapısal analiz, E162'nin protonasyonunun DNA'ya bağlanan R230 amino asidi üzerindeki etkisini ortaya koymuştur. Ayrıca, E162 protonlandığında, protein halka yapısı kararlı kalmıştır. D223-S224 peptit bağının cis konfigürasyonunda olduğu durumlarda ATP Walker A ve Walker B motiflerine diğer ATPazlarda olduğu gibi kanonik bir şekilde bağlanmıştır. Ancak, peptit bağı trans konfigürasyonunda olduğunda, ATP, Mg²⁺ ve Walker A ve Walker B motifleri arasındaki etkileşimler bozulmuş ve bağlanma zayıflamıştır. Nükleotit içermeyen durumda, trans konfigürasyonunda protonlanmış E162 daha kararlı görünmüştür. ATP bağlandıktan sonra yapısal davranış değişmiş ve birden fazla konfigürasyon mümkün hale gelmiştir. Simülasyonlar, trans protonlanmış E162, trans protonlanmamış E162 ve cis protonlanmamış E162 'nin karşılaştırılabilir miktarlarda mevcut olabileceğini ve ATP bağlanması ve buna bağlı yapısal esneklik tarafından yönlendirilen dinamik bir dengeyi işaret ettiğini göstermiştir. Sonuç olarak, bu simülasyonlar, Dmc1 proteininin dinamik davranışını, interdomain etkileşimlerini, potansiyel DNA bağlanma mekanizmalarını ve halka-filament geçişlerini daha iyi anlamaya yönelik moleküler düzeyde derinlemesine bilgiler sağlamış ve homolog rekombinasyon süreçlerine dair kapsamlı bir bilgi sunmuştur. Lipazlar, triacilgliserollerdeki ester bağlarını hidrolize eden ve ayrıca esterifikasyon, interesterifikasyon ve alkoliz reaksiyonlarını katalize edebilen enzimlerdir. Deterjan, gıda, tekstil, biyoyakıt ve ilaç gibi geniş endüstriyel uygulamalarda kullanılırlar. Mikrobiyal lipazlar, özellikle Geobacillus türlerinden elde edilenler, yüksek sıcaklık optimumları ve genetik uyarlanabilirlikleri ile dikkat çeker ve birçok endüstri için ideal hale gelirler. Lipaz enzimleri üzerinde gerçekleştirilen moleküler dinamik simülasyonları, yapısal esneklik ve katalitik verimlilik açısından karşılaştırmalı bilgiler sunmuştur. Lipaz simülasyonları, aktif bölge esnekliğinin substrat bağlanması ve enzimatik aktivite üzerindeki etkilerini vurgulayarak protein davranışlarına daha geniş bir perspektif sunmuştur. Substratın aktif bölgeye bağlanması sırasında gözlemlenen yapısal yeniden düzenlemeler, lipazların yüksek substrat seçiciliğini ve enzimatik etkinliğini artıran önemli faktörler olarak tanımlanmıştır.
Özet (Çeviri)
Both homologous recombination and enzymatic processes, such as those catalyzed by lipases, play essential roles in biological systems, with wide-reaching applications in science and industry. Scientists have studied homologous recombination for a long time to understand its evolution, mechanics, and biological significance. The involvement of the Dmc1 protein in the context of homologous recombination is the focus of this study's thorough investigation of these features. Recombinases, such as Rad51 and Dmc1, which are found in eukaryotes, are essential for homologous recombination and DNA repair. Despite significant sequence similarities, Rad51 and Dmc1 serve different purposes; although Rad51 is essential for DNA repair, Dmc1 participates in homologous recombination during meiosis. More details about its structure and activities are revealed, including the involvement of ATP binding sites and the precise amino acids required for ssDNA binding. Loop areas have been found to be essential for DNA binding. Dmc1 has been characterized by several crystal structures showing an octameric ring configuration in the absence of ATP and DNA. Additionally, it has crystal structures in filament form. These different structures provide valuable insights into the structural flexibility of Dmc1 and its mechanism of interaction with DNA. Molecular dynamics simulations were performed on human Dmc1 protein in various oligomeric states to investigate its structural and dynamic behavior. This study aimed to explore the effects of nucleotide binding, protonation states, and peptide bond isomerization on the stability and conformational dynamics of Dmc1's N- and C-terminal domains. Key simulations included standard molecular dynamics, thermodynamic integration for pKa calculations, and umbrella sampling for free energy profiling. Protonation states of residues E162 and H295, cis-trans isomerization of the D223-S224 peptide bond, and nucleotide-binding states (ATP, ADP, or nucleotide-free) were systematically examined. Root mean square deviation (RMSD) analyses showed distinct equilibration dynamics for the C-terminal domain, while the N-terminal domain displayed significant mobility. Structural analysis revealed the connection between the protonation of E162 and its influence on DNA-binding residue R230. Besides, when E162 is protonated, the ring structure of the protein remains stable. when the D223-S224 peptide in a cis configuration, ATP binds to the Walker A and Walker B motifs in a canonical manner, similar to how ATP binding occurs in other ATPases. However, when the peptide bond is in the trans configuration, the interactions between ATP, Mg²⁺, and the Walker A and Walker B motifs are disrupted, weakening the binding. In the nucleotide-free state, the trans configuration with E162 appears more stable. Upon ATP binding, the structural behavior changes, and multiple configurations become possible. Simulations indicate that trans isomer with protonated E162, trans isomer with unprotonated E162, and cis isomer with unprotonated E162 likely exist in comparable amounts, suggesting a dynamic equilibrium driven by ATP binding and associated conformational flexibility of the protein. Additionally, molecular dynamics simulations on lipase enzymes offered comparative insights into structural flexibility and catalytic efficiency. Lipase dynamics highlighted the role of active site flexibility in substrate binding and enzymatic activity, providing a broader perspective on protein behavior. Overall, the simulations enhanced the understanding of Dmc1's dynamic behavior, interdomain interactions, and potential DNA-binding mechanisms, contributing to deeper molecular-level insights into homologous recombination processes.
Benzer Tezler
- Investigating molecular interaction networks of nuclear factor one transcription factors
Nükleer faktör I transkripsyon faktörlerinin moleküler etkileşim ağlarının araştırılması
DİCLE MALAYMAR PİNAR
Doktora
İngilizce
2024
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
DOÇ. DR. MARKKU VARJOSALO
- BIOINTERFACIAL CELL/PROTEIN–POLYMER INTERACTIONS INVESTIGATED BY QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE WITH DISSIPATION
Hücre/protein–polimer biyoarayüzündeki etkileşimlerin disipasyon izlemeli kuvars kristal mikroterazi ile incelenmesi
AYŞE BUSE ÖZDABAK SERT
Doktora
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULHALİM KILIÇ
- Molecular dynamics simulations of chk2 kinase domain mutants
CHK2 kı̇naz domain mutantlarının moleküler dı̇namı̇k sı̇mülasyonları
EBRU TUNCAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
Genetikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MERT GÜR
- In vitro and in silico investigation of NFIB-SUMO interactions
NFIB-SUMO etkileşimlerinin in vitro ve in silico olarak incelenmesi
AYBERK ÖZKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of the potential of antibiofilm effective agents to overcome drug resistance developed in hepatocellular carcinoma
Hepatosellüler karsinomda gelişen ilaç direncinin aşılması için antibiyofilm etkili ajanların potansiyellerinin araştırılması
NİSA BALTACI
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
BiyolojiKadir Has ÜniversitesiDisiplinlerarası Mühendislik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. EBRU BİLGET GÜVEN