İnsülin sinyal iletimi ara bileşenlerinden insülin reseptör substrat-1 (IRS1) proteininin görevlerinin CRISPR/CAS9 sistemi kullanılarak araştırılması
Investigation of the functions of insulin receptor substrate-1 (IRS1) protein, a mediator of insulin signaling, using the CRISPR/CAS9 system
- Tez No: 927499
- Danışmanlar: PROF. DR. GÖKHAN SADİ, DR. AYKUT BOSTANCI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Biology, Bioengineering, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Karamanoğlu Mehmetbey Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 85
Özet
İnsülin sinyal iletiminde kritik bir düzenleyici olan insülin reseptör substratı-1 (IRS1), hücresel glukoz alımı, glikojen sentezi, protein üretimi ve hücre büyümesi gibi metabolik ve mitojenik süreçleri yönlendiren bir adaptör proteindir. Disfonksiyonu, insülin direnci, tip 2 diyabet ve metabolik sendrom gibi hastalıklarla ilişkilendirilmiş olsa da, IRS1'in karaciğer hücrelerindeki moleküler etki mekanizmaları henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada, irs1 geninin CRISPR-Cas9 teknolojisi ile susturulmasının insülin sinyal iletimi ve lipid metabolizmasımda görevli genler üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bu kapsamda IRS1 genini hedeflemek amacıyla iki farklı gRNA tasarlanmış ve bunları içeren ribonükleoprotein kompleksleri tekil ve birlikte Clone-9 hücrelerine transfekte edilmiştir. Transfeksiyon verimi, farklı hücre yoğunlukları ve inkübasyon süreleri açısından test edilmiştir. Ayrıca farklı CRISPR-Cas9 sistemlerinin irs1 genini düzenleme etkinliği, T7E1 endonükleaz analiziyle değerlendirilmiş ve PCR ile doğrulanmıştır. İnsülin sinyal ietim yolağı genlerinden irβ, irs1, irs2, pi3k, akt, mtor ve foxo3a ile lipid metabolizması düzenleyicileri srebp-1c, fasn ve pparγ'nin gen ekspresyon seviyeleri qRT-PCR ile ölçülmüştür. Sonuçlara göre en yüksek transfeksiyon verimliliği, 40.000 hücre yoğunluğu ve 48 saatlik inkübasyon süresinde elde edilmiştir. Çalışmada kullanılan IRS1_AA gRNA, gen susturma etkinliği açısından IRS1_AB gRNA ve multi-gRNA kombinasyonuna kıyasla daha güçlü bir performans sergilemiştir. IRS1 geninin susturulması, PI3K-Akt-mTOR ekseninde gen ekspresyonunda anlamlı bir azalmaya yol açmıştır. Ayrıca lipid metabolizmasına yönelik analizlerde, srebp-1c, fasn ve pparγ'nin gen ekspresyon seviyelerinde irs1 susturulmasına bağlı olarak baskılanma gözlenmiş olup, irs1 geninin CRISPR-Cas9 teknolojisi ile susturulmasının insülin sinyal yolağı ve lipid metabolizmasında belirgin etkiler yarattığı görülmüştür. Sonuç olarak bu çalışma, IRS1 geninin CRISPR-Cas9 teknolojisi ile susturulmasının insülin sinyalizasyonu ve lipid metabolizması üzerinde önemli moleküler değişikliklere yol açtığını göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Insulin receptor substrate-1 (IRS1), a critical regulator in insulin signaling, is an adaptor protein that governs metabolic and mitogenic processes such as cellular glucose uptake, glycogen synthesis, protein production, and cell growth. Although its dysfunction has been associated with diseases such as insulin resistance, type 2 diabetes, and metabolic syndrome, the molecular mechanisms of IRS1 in hepatocytes remain incompletely understood. In this study, the effects of silencing the irs1 gene using CRISPR-Cas9 technology on genes involved in insulin signaling and lipid metabolism were investigated. For this purpose, two different gRNAs targeting the IRS1 gene were designed, and ribonucleoprotein complexes containing these gRNAs were transfected individually and in combination into Clone-9 cells. Fluorescence microscopy were used to confirm the transfection efficiency, which was tested under different cell densities and incubation time. Furthermore, the gene-editing efficiency of different CRISPR-Cas9 systems targeting the irs1 gene was evaluated using T7E1 endonuclease assay and confirmed by PCR. The expression levels of insulin signaling pathway genes (irβ, irs1, irs2, pi3k, akt, mtor, and foxo3a) and lipid metabolism regulators (srebp-1c, fasn, and pparγ) were measured by qRT-PCR. According to the study results, the highest transfection efficiency was achieved at a cell density of 40,000 and an incubation period of 48 hours. Among the gRNAs used, IRS1_AA gRNA demonstrated superior performance in gene silencing compared to IRS1_AB gRNA and the multi-gRNA combination. Silencing of the IRS1 gene resulted in a significant decrease in gene expression along the PI3K-Akt-mTOR axis. Additionally, in lipid metabolism analyses, suppression of srebp-1c, fasn, and pparγ gene expression was observed following irs1 silencing, indicating that CRISPR-Cas9-mediated silencing of the irs1 gene has pronounced effects on both insulin signaling and lipid metabolism. In conclusion, this study demonstrates that silencing the IRS1 gene using CRISPR-Cas9 technology leads to significant molecular changes in insulin signaling and lipid metabolism, suggesting potential therapeutic implications.
Benzer Tezler
- Kurbağa, Rana ridibunda (Amphibia-Anura) böbreküstü bezinin çeşitli tip hüzreleri arasındaki etkileşme mekanizmaları
Mechanism of interactions among different types of cells in the adrenal glands of frog Rana ridibunda (Amphibia-Anura)
SONGÜL SÜREN CASTİLLO
- İnsülin sinyal iletiminde P38 kinazın rolünün araştırılması
Determine the role of P38 kinase in insulin signaling
GÖKHAN GÖRGİŞEN
Doktora
Türkçe
2015
GenetikAkdeniz ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. OSMAN NİDAİ ÖZEŞ
- İnsülin sinyal iletimini düzenleyen potansiyel mikroRNA moleküllerinin belirlenmesi ve bu mikroRNA'ların fonksiyonel analizleri
Determination of potential microRNA molecules regulating insulin signal transduction and functional analysis of these microRNAs
AYKUT BOSTANCI
Doktora
Türkçe
2022
BiyolojiKaramanoğlu Mehmetbey ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÖKHAN SADİ
- Hypericum perforatum l. özütünün ve etken bileşiği hiperisinin adiposit hücrelerinde insülin sinyal iletimi ve intrasellüler organizasyona etkisinin moleküler ve biyoinformatik analizler ile incelenmesi
Investigation of the effect of Hypericum perforatum l. extract and its active compound hypericin on insulin signal transduction and intracellular organization in adipocyte cells by molecular and bioinformatic analyses
HİLAL BÜŞRA TOKGÖZ BOZKURT
Doktora
Türkçe
2025
BiyoteknolojiMuğla Sıtkı Koçman ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FİLİZ ALTAN
- Deneysel diyabetik kardiyomiyopatide hücre içi serbest iyon derişimi
Cellular free ion concentration in experimental diabetic cardiomyopathy
MURAT AYAZ