Geri Dön

Mikrofunguslarda ribotoksin üretiminden sorumlu gen bölgesinin saptanması, ribotoksin üretiminin araştırılması ve bazı kanser hücrelerinde sitotoksik etkisinin incelenmesi

Determination of gene region responsible for ribotoxin production in microfungi, research of ribotoxin production and investigation of cytotoxic effect in some cancer cells

PDF İndir

  1. Tez No: 928125
  2. Yazar: BAHAR GÖKÇEN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ÖZLEM ABACI GÜNYAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biology, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Ribotoksin, Mikrofungus, Fungal toksin, Sitotoksisite testi, Ribotoxin, Microfungus, Fungal toxins, cytotoxicity test
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ege Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 143

Özet

Çalışmanın amacı, mikrofunguslarda ribotoksin üretiminden sorumlu gen bölgesinin varlığını belirlemektir. Ayrıca, bu gen bölgesine sahip mikrofunguslardan ribotoksin üretimini gerçekleştirmek ve bu üretimi gerçekleştirme durumunda bazı kanser hücrelerinde sitotoksik etkisinin incelenmesidir. Fungal sekonder metabolitler olan ribotoksinler, 28S rRNA'da yüksek oranda korunan sarcin/ricin alanında bulunan bir fosfodiester bağ üzerinde özel bir nükleolitik aktivite sergiler. Protein sentezi inhibisyonuna ve hücre ölümüne neden olurlar. Çalışmamızda çeşitli tarım arazileri toprakları, kaplıca suları etrafı gibi ekstrem koşullar barındıran bölgelerdeki topraklar, açıkta satışa sunulan baharatlar ve bitkisel kökenli hayvan besi yemleri hammaddelerinin depolarından, silolardan 165 adet mikrofungus izole edilmiştir. İzole edilen tüm fungusların fenotipik yöntemler ile genus düzeyinde tanılaması yapılmıştır. Funguslarda ribotoksin üretiminden sorumlu gen bölgesine özel olan 2 farklı primer çifti ile PCR çalışması gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, genus düzeyinde fenotipik tanısı yapılmış olan izolatlarda ribotoksin gen bölgesi olup olmadığını belirlemek için yapılmıştır. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezinde görüntülenmiş ve 8 örnekte α-sarcin bandı olduğu düşünülen bantlar gözlemlenmiştir. PCR sonuçları sekans analizine gönderilmiş ve sekans sonuçlarının analizi için Finch TV (Blast) ve ApE programları kullanılmıştır. Nükleotid dizilerinin karşılaştırılması, araştırmacıların kendileri için kullanıma açık, Gen Bankası'nın (NCBI) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi sayfasında yapılmıştır. Yapılan araştırmalara göre, 165 fungal izolattan 3 tanesinde ribotoksin üretiminden sorumlu gen bölgesi tespit edilmiştir. Diğer 5 izolatın sekans sonuçları“hypothetical protein”ve“uncharachterized protein”olarak tespit edilmiştir. Ribotoksin üretiminden sorumlu gen bölgesini taşıyan fungusların genotipik tanısı için, ITS gen bölgesi olarak adlandırılan ve funguslarda evrensel şekilde korunmuş olan gen bölgesi için özel olan evrensel primerler ITS1-ITS4 primerleriyle PCR gerçekleştirilmiş ve PCR ürünleri sekans analizine gönderilmiştir. Elde edilen sonuçlar NCBI sayfasında incelenerek genotipik tanılama yapılmıştır. Ribotoksin gen bölgesi varlığı tespit edilen 3 fungal izolat ve hypothetical protein gen bölgesi ile uncharacterizied protein gen bölgesi taşıdığı belirlenen 5 izolat ribotoksinlerin spesifik ribonükleaz aktivitesi (α-fragmentinin salınması) tayini gerçekleştirilerek izolatların 28S RNA'dan yaklaşık 400 bazlık bir nükleotid parçasını (α-fragment) koparma aktivitesinde bulunması incelenmiştir. Bu incelemenin sonucunda 4 izolat bu aktiviteyi göstermiştir. PCR çalışması sonunda funguslarda ribotoksin üretiminden sorumlu gen bölgesini taşıdığı düşünülen 8 izolatın da ribotoksin üretimi için tanımlanmış besiyerinde üretimi ve SDS'li polyacrylamide gel elektrofezi gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonucunda 1 izolatta ribotoksin olduğu düşünülen proteine ait 18 kD boyutunda bant gözlenmiştir. Daha sonrasında bu izolatlardan kısmı saflaştırma ile ribotoksin üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu izolatlardan 5 tanesi ile hücre kültürü ve canlılık çalışmaları yapılmıştır. Çalışmada İnsan pankreatik kanseri hücre hattı PANC1, İnsan akciğer kanseri hücre hattı A549, Prostat kanseri hücre hattı PC3,, tümörojenik olmayan insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293, insan göğüs adenokarsinoma hücre hattı MDA-MB-231 ve nöroblastoma hücre hattı SHSY5Y hücreleri kullanılmıştır. Üretilen ribotoksin örneklerinin kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkiye bakılması amacıyla M.T.T (3-(4,5-Di methyl thiazol-2-yl)-2,5- Di fenil tetrazolium Bromid) canlılık çalışması yapılmıştır. 1 numaralı izolat olan Aspergillus fumigatus suşu Panc-1 ve PC-3 hücre hatlarına karşı sırasıyla %66,9 ve %65 sitotoksisite göstermiştir.

Özet (Çeviri)

The aim of our study is to determine the presence of the gene region responsible for ribotoxin production in microfungi and to perform ribotoxin production from microfungi with this gene region and to examine the cytotoxic effect of this production in some cancer cells. Fungal secondary metabolites known as ribotoxins are members of a family of ribosome inactivating proteins. They cause cell death through apoptosis and inhibit protein synthesis by exhibiting a highly specific nucleolytic activity on a phosphodiester bond in the highly conserved sarcin/ricin domain in 28S rRNA. In our study, 165 microfungi were isolated from the soils of various agricultural lands, soils in regions with extreme conditions such as around hot springs, spices for sale in the open market, and silos and warehouses of plant-based animal feed raw materials. Phenotypic identification of all isolated fungi was performed at the genus level using phenotypic methods. PCR was performed with 2 different primer pairs specific for the gene region responsible for ribotoxin production in fungi. This study was carried out to determine whether there is a ribotoxin gene region in the isolates phenotypically identified at the genus level. PCR products were visualized on agarose gel electrophoresis and bands thought to be α-sarcin bands were observed in 8 samples. PCR results were sent for sequence analysis and Finch TV (Blast) and ApE programs were used to analyze the sequence results. The comparison of nucleotide sequences was done on the Gene Bank (NCBI) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi page, which is available for the researchers themselves. According to the results, 3 out of 165 fungal isolates had the gene region responsible for ribotoxin production. The sequence results of the other 5 isolates were identified as“hypothetical protein”and "uncharacterized protein for genotypic identification of fungi carrying the gene region responsible for ribotoxin production, PCR was performed with the universal primers ITS1-ITS4, which are specific for the gene region called the ITS gene region and is universally conserved in fungi, and the PCR products were sent for sequence analysis. The obtained results were examined on the NCBI page and genotypic identification was performed. The specific ribonuclease activity (release of α-fragment) of ribotoxins was determined in 3 fungal isolates with ribotoxin gene region and 5 isolates, with hypothetical protein gene region and uncharacterizied protein gene region, and the activity of the isolates to cleave a nucleotide fragment (α-fragment) of approximately 400 bases from 28S RNA was examined. As a result of this examination, 4 isolates showed this activity. At the end of the PCR study, 8 isolates, which were thought to carry the gene region responsible for ribotoxin production in fungi, were grown on medium defined for ribotoxin production and polyacrylamide gel electrophoresis with SDS was performed. As a result of this study, an 18 kD band belonging to the protein thought to be ribotoxin was observed in 1 isolate. Subsequently, ribotoxin production was carried out from these isolates by partial purification. Cell culture and cytotoxicity studies were performed with 5 of these isolates. Human pancreatic cancer cell line PANC1, human lung cancer cell line A549, prostate cancer cell line PC3, non-tumorigenic human embryonic kidney cell line HEK293, human breast adenocarcinoma cell line MDA-MB-231 and neuroblastoma cell line SHSY5Y cells were used in the study. M.T.T (3-(4,5-Di methyl thiazol-2-yl)-2,5- Di phenyl tetrazolium Bromide) viability test was performed to investigate the cytotoxic effect of the ribotoxin samples on cancer cells. Aspergillus fumigatus strain, isolate number 1, showed 66.9% and 65% cytotoxicity against Panc-1 and PC-3 cell lines, respectively.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    233646

    Toprak kökenli mikrofunguslarda lipaz üreten suşların araştırılması, lipaz saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Investigating of lipase producing strains of microfungi with origin soil, purification and characterization of lipase

    SERDAR ÜLKER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2009

    BiyokimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ŞENGÜL ALPAY KARAOĞLU

  2. Tez No

    185113

    Yukarı büyük menderes nehri havzasındaki makrofunguslarda ağır metaliçeriklerinin araştırılması

    Research on the heavy metal contents of the macrofungi of the upper büyük menderes river basin

    NAZMİ DURKAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    BiyolojiSüleyman Demirel Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. KUDRET KABAR

    PROF.DR. MUSTAFA IŞILOĞLU

  3. Tez No

    27970

    Erzurum il sınırları içerisindeki bazı ilçe ve köylerde bulunan sığır ve koyun ahırlarındaki gübrelerin termifil ve termotole rant mikrofungus florası üzerine bir araştırma

    Başlık çevirisi yok

    SELAMİ YEŞİLYURT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1993

    Veteriner HekimliğiAtatürk Üniversitesi

    Fen Bilimleri Eğitimi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSMET HASENEKOĞLU

  4. Tez No

    679511

    Armoracia rusticana G.Gaertn., B.Mey. & Scherb. (bayırturpu) bitkisinin çeşitli tarla ve depo mikrofunguslarına karşı antifungal etkinliğinin araştırılması

    Investigation of the antifungal effectiveness of Armoracia rusticana G.Gaertn., B.Mey. & Scherb. (horseradish) against various field and storage microfungi

    MOUSSA KIOURT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    MikrobiyolojiTrakya Üniversitesi

    Biyoteknoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HALİDE AYDOĞDU

  5. Tez No

    337214

    Tuz gölü'nden izole edilen Aspergillus ve Penicillium cinsi türlere ait metabolitlerin antioksidan ve anti-proliferatif etkilerinin belirlenmesi

    Determining the antioxidant and antiproliferative effects of genus of Aspergillus and Penicillium species belonging to metabolites isolated from Salt lake

    ZERRİN CANTÜRK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    MikrobiyolojiEskişehir Osmangazi Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEMRA İLHAN

Geri Dön