Geri Dön

Discovery of small molecules with inhibitory potential and therapeutic peptide design against clostridium difficile infection

Clostridium difficile enfeksiyonuna yönelik inhibitör potansiyeline sahip küçük molekül keşfi ve terapötik peptid tasarımı

PDF İndir

  1. Tez No: 946062
  2. Yazar: DAMLA NUR ÇAMLI
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ SALİHA ECE ACUNER ZORLUUYSAL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biyomühendislik, Biology, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Medeniyet Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 102

Özet

Clostridium difficile (C. difficile), insan gastrointestinal sisteminde ciddi enfeksiyonlara neden olan Gram pozitif, spor oluşturan ve anaerobik bir bakteridir (1). Özellikle antibiyotik kullanımı sonrası bağırsak mikrobiyotasının bozulması sonucu ortaya çıkan bu patojen, klinik olarak hafif ishalden, psödomembranöz kolit ve toksik megakolon gibi hayatı tehdit eden ağır durumlara yol açabilmektedir (2,3). Bu enfeksiyonlar, özellikle yaşlı bireyler ve hastane ortamında yatan hastalar arasında daha yaygındır ve yüksek morbidite ile mortaliteye neden olmaktadır (1). Dolayısıyla, Clostridium difficile enfeksiyonları (CDI) dünya çapında önemli bir halk sağlığı problemi olarak kabul edilmektedir (4). Clostridium difficile enfeksiyonları'nın (CDI) patogenezinde başlıca virülens faktörleri, Toksin A (TcdA) ve Toksin B (TcdB) olarak bilinmektedir (5). Bu iki toksinden özellikle Toksin B, yüksek sitotoksisiteye sahip olması nedeniyle hastalığın oluşumunda daha baskın bir role sahiptir (6). TcdB, glukoziltransferaz aktivitesi yoluyla konak hücrelerdeki Rho ailesi GTPaz proteinlerini (Rac1, RhoA, Cdc42 gibi) modifiye eder (5). Bu modifikasyon, aktin iskeletinin bozulmasına yol açarak hücre iskeletinin dinamiklerini etkiler, hücrelerde apoptoz ve yapısal bütünlük kaybı gibi patolojik değişikliklerin ortaya çıkmasına neden olur (7). TcdB'nin hastalık patogenezindeki merkezi rolü, bu toksini terapötik müdahaleler açısından öncelikli ve stratejik bir hedef haline getirmektedir. Mevcut antibiyotiklerin özellikle yüksek nüks oranları ve bağırsak mikrobiyotasına zarar verme potansiyeli nedeniyle, toksin hedefli tedavi yaklaşımları ön plana çıkmaktadır (1). Bu çalışmanın temel amacı, TcdB ve konak proteinleri arasındaki moleküler mekanizmayı anlamak ve bu doğrultuda TcdB'yi doğrudan hedef alarak inhibitör küçük moleküller ve terapötik peptidler tasarlamaktır. Nihai amaç olarak ise, Clostridium difficile enfeksiyonuna yönelik yenilikçi tedavi stratejileri geliştirmek hedeflenmektedir. In Silico Yöntemlerin Araştırmadaki Rolü ve Önemi Günümüzde özellikle hedefe yönelik ilaç keşfi süreçlerinde in silico yaklaşımlar, modern biyomedikal araştırmaların vazgeçilmez araçları haline gelmiştir.“In silico”terimi, bilgisayar destekli ortamda gerçekleştirilen moleküler modelleme, simülasyon ve hesaplamalı analizleri ifade eder (8). Bu yöntemler, geleneksel laboratuvar tekniklerinin zamansal ve finansal sınırlamalarını aşarak, geniş moleküler kütüphaneler içerisinden kısa sürede ve maliyet etkin biçimde potansiyel aday bileşiklerin taranmasına olanak tanımaktadır. Aynı zamanda, bu yaklaşımlar erken aşamada deneysel doğrulama gerektiren moleküllerin daha rasyonel bir şekilde seçilmesini sağlayarak, ilaç keşfi süreçlerinin etkinliğini artırmaktadır (8). In silico yaklaşımların en önemli avantajlarından biri de, moleküler düzeyde atomik etkileşimlerin ve dinamiklerin yüksek çözünürlükte analiz edilebilmesidir (8). Özellikle moleküler dinamik simülasyonları, protein-ligand etkileşimlerinin zaman içindeki davranışlarını, bağlanma süreçlerini ve yapısal stabiliteyi ayrıntılı biçimde ortaya koyar. Bu sayede, deneysel olarak yakalanması zor olan geçici ara yapılar ve moleküler mekanizmalar hakkında kapsamlı bilgiler elde edilebilir (9). Bu tez kapsamında, Clostridium difficile TcdB toksininin konak hücre GTPaz proteinleri (Rac1 ve Cdc42) ile olan etkileşimleri, moleküler dinamik simülasyonları ve serbest enerji hesaplamaları aracılığıyla incelenmiştir. Bu analizler doğrultusunda, toksin-inhibitör bağlanma bölgelerinin yapısal stabilitesi, seçiciliği ve etkileşim mekanizmaları moleküler düzeyde tanımlanmıştır. Ayrıca in silico yöntemler, etik ve deneysel risklerin azaltılmasında da önemli bir rol üstlenmektedir. Yeni geliştirilen moleküllerin toksisite ve farmakokinetik profilleri, deneysel testler öncesinde sanal ortamda tahmin edilerek gereksiz hayvan deneyleri ve laboratuvar testlerinin önüne geçilebilir. Bu tezde de benzer şekilde, tasarlanan terapötik peptidlerin toksisite tahminleri ToxinPred gibi biyoinformatik araçlarla gerçekleştirilmiş ve yalnızca toksik olmayan adaylar değerlendirmeye alınmıştır (10,11). Bunun yanı sıra, in silico analizler birden fazla parametrenin eş zamanlı değerlendirilmesine olanak tanır (12). Bağlanma enerjisi, yapı esnekliği, hidrojen bağları, elektrostatik etkileşimler gibi çok sayıda yapısal ve dinamik özellik birlikte analiz edilerek, yalnızca hedefe yüksek afiniteyle bağlanan değil, aynı zamanda yapısal kararlılığa sahip inhibitör adaylarının belirlenmesi mümkün olur (10,13). Böylece ilaç tasarım süreci daha bütüncül ve güvenilir hale getirilir. TcdB'nin Yapısal ve Fonksiyonel Analizi Clostridium difficile toksini B (TcdB), dört ana fonksiyonel bölgeden oluşur: N-terminal glukoziltransferaz domeni (GTD), otokatalitik proteaz domeni (CPD), ve C-terminal tekrarlayan oligopeptit dizileri (CROPs) (14). Bu modüler yapı, toksinin konak hücre proteinleriyle etkileşiminde ve toksik etkilerinin oluşmasında kritik rol oynar (15,16). GTD, Rho ailesi GTPaz proteinlerini (örneğin Rac1, RhoA, Cdc42) hedef alarak glukozilasyon yoluyla işlevlerini inhibe eder (16). CPD, inositol hekzafosfat (IP6) tarafından aktive edilen otokatalitik aktivite ile GTD'yi serbestleştirir (5). TD, toksinin endozomal membranlardan sitozole geçişini sağlar (5). CROPs bölgesi ise hücre yüzeyindeki glikanlara bağlanarak hücreye özgü tanımayı gerçekleştirir (1). TcdB'nin konak GTPaz proteinleriyle etkileşimini anlamak amacıyla, Protein Data Bank (PDB) (17) veritabanındaki kristal yapılar kullanılarak yapısal analizler gerçekleştirilmiştir. Bu analizler, bağlanma bölgelerinin seçiciliğini tanımlamak ve yapı-temelli inhibitör tasarımı geliştirmek açısından önemlidir. Bu tez kapsamında yapılan ve literatürde“MuGger Toxins: Exploring the Selective Binding Mechanism of Clostridial Glucosyltransferase Toxin B and Host GTPases”başlığıyla yayımladığımız çalışmada, TcdB'nin Rac1 ve Cdc42 ile etkileşimleri moleküler dinamik simülasyonlar ve serbest enerji hesaplamaları ile detaylı biçimde incelenmiştir (18). Elde edilen bulgular, toksin-seçicilik ilişkisini moleküler düzeyde ortaya koymuş ve hedefe yönelik inhibitör geliştirme sürecine katkı sağlamıştır (18). Moleküler Dinamik Simülasyonları ve Modellenen Kompleks Yapıların Kararlılık Çalışmaları TcdB ve konak proteinlerin oluşturduğu kompleksler, GTP ve GDP bağlanmış Rac1, Cdc42, Cd46 ve Nectin3 konak proteinleri kullanılarak modellenmiş ve moleküler dinamik simülasyonları yapılmıştır. GROMACS (19) programı ve CHARMM36m (20,21) kuvvet alanı kullanılarak üç farklı replikasyon halinde 500 ns'lik simülasyonlar yürütülmüştür. Bu simülasyonlar, toksin-konak etkileşimlerinin dinamik doğasını ve bağlanma kararlılığını (stabilitesini) ayrıntılı şekilde ortaya koymuştur. Simülasyonların analizinde RMSD, RMSF, hidrojen bağı sayısı ve MM-PBSA bağlanma enerjisi gibi parametreler hesaplanarak, toksinin bağlanma bölgelerinin stabilitesi ve inhibitör tasarımındaki kritik önemi belirlenmiştir. Gelişmiş Örnekleme Teknikleri: Metadinamik ve Umbrella Sampling TcdB-Rac1 kompleksinin dinamik bağlanma süreçlerini daha detaylı incelemek için Well-Tempered Metadynamics (WT-MetaD) (22) simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Konak GTPaza GTP ve GDP bağlı formdaki yapıları içeren kompleksler için yapılan simülasyonlar, potansiyel serbest enerji yüzeylerinin şekillenmesini ortaya koymuştur. Merkezler arası mesafe ve yarıçap gibi kolektif değişkenler kullanılarak, bağlanma yolları moleküler düzeyde tanımlanmıştır. Buna ek olarak umbrella sampling yöntemiyle potansiyel serbest enerji (PMF) eğrileri hesaplanmış ve WHAM algoritması ile analiz edilmiştir (19,22). Bu çalışmalar, toksin-GTPaz seçiciliğinin enerji temelli anlaşılmasına katkı sağlamıştır. Küçük Molekül Sanal Taraması ve İlaç Adayları TcdB'nin aktif bölgesine bağlanabilecek inhibitör küçük moleküller, ZINC (21) veritabanından seçilen binlerce bileşik üzerinde sanal tarama yöntemi ile incelenmiştir. Moleküller, Lipinski kuralı, kan-beyin bariyeri geçişi ve ADMET özellikleri açısından değerlendirilmiştir. Seçilen dört molekül, bağlanma enerjileri ve farmakofor özelliklerine göre belirlenmiş ve UDP-glukoz bağlanma bölgesine bağlanarak toksin aktivitesini engelleme potansiyeli göstermiştir. Bu bağlanma, toksinin hücre içine girmeden işlevini bloke etmesine olanak sağlamaktadır. Terapötik Siklik Peptid Tasarımı ve Toksisite Analizleri TcdB'nin konak proteinlerle etkileşimde bulunduğu bölgeler baz alınarak terapötik peptid dizileri tasarlanmıştır. Tasarlanan peptidlerin bağlanabilirlikleri moleküler kenetlenme (docking) analizleri ile değerlendirilmiş, toksisite ise ToxinPred (11) ve BLAST (23) gibi araçlarla analiz edilmiştir. Toksik olmayan ve insan proteinleri ile düşük homoloji gösteren iki siklik peptid AMBER14SB (24) kuvvet alanı ve TIP3P su modeli altında moleküler dinamik simülasyonlarına tabi tutulmuştur. RMSD, RMSF, hidrojen bağları, zamanla bağlanma mesafeleri ve MM-GBSA bağlanma enerjileri hesaplanarak peptidlerin toksinin bağlanma bölgelerinde yüksek afinite ve stabilite gösterdiği tespit edilmiştir. Entegre Enerji Analizleri ve Karşılaştırmalı Simülasyonlar Küçük molekül ve peptid inhibitörlerin TcdB ile oluşturduğu komplekslerin bağlanma enerjileri MM-GBSA yöntemi ile karşılaştırılmıştır. Siklik peptidlerin hem fiziksel bağlanma hem de UDP bölgesi ile etkileşim yoluyla çift yönlü blokaj mekanizması geliştirdiği gözlemlenmiş, bu da inhibitör etkinliğini artırmıştır. Sonuç ve Tartışma Bu çalışmada, Clostridium difficile (C. difficile) bakterisinin toksinlerinden özellikle TcdB'nin yapısal ve fonksiyonel özellikleri detaylı bir şekilde moleküler düzeyde incelenmiştir. TcdB'nin, konak hücrelerdeki Rho ailesi GTPaz proteinlerine bağlanarak toksik etkisini gerçekleştirdiği bilinmektedir (14) . Bu çalışmada, bu bağlanma mekanizması bilgisayar ortamında simüle edilerek toksinin davranışları ve etkileşimleri daha derinlemesine analiz edilmiştir. Gerçekleştirilen moleküler dinamik (MD) simülasyonları, TcdB'nin farklı GTPaz proteinleri ile oluşturduğu komplekslerin zaman içindeki davranışlarını ortaya koymuştur. Bu simülasyonlar sayesinde toksinin hedef proteinlere bağlanma stabilitesi ve seçiciliği hakkında önemli veriler elde edilmiştir. Özellikle, toksinin aktif bölgelerindeki bağlanma dinamiklerinin, inhibitör geliştirme sürecinde kritik rol oynadığı görülmüştür. Bu noktada, bilgisayar destekli in silico yöntemlerin araştırmalardaki önemi oldukça büyüktür. Geleneksel laboratuvar deneylerine kıyasla bu yöntemler, çok daha hızlı, düşük maliyetli ve yüksek verimlidir (12). Örneğin, binlerce küçük molekülü ve peptidi sanal ortamda test etme olanağı, laboratuvar ortamında yıllar sürebilecek tarama işlemlerinin saatler içinde tamamlanmasını mümkün kılmaktadır. Böylece, en umut verici aday moleküller belirlenerek deneysel aşamalara odaklanılabilir; bu da ilaç keşfi süreçlerini hızlandırmakta ve maliyetleri önemli ölçüde azaltmaktadır (25). Çalışmamızda, TcdB'nin hedef proteinlerle etkileşiminde kritik öneme sahip bağlanma bölgeleri moleküler modelleme ve simülasyon teknikleriyle detaylandırılmıştır. Bu sayede toksinin bağlanma şekli ve seçiciliği moleküler düzeyde daha net ortaya konmuştur. Ayrıca, toksin ile GTP ve GDP bağlı GTPaz proteinleri arasındaki etkileşimlerin termodinamik ve kinetik özellikleri gelişmiş simülasyon yöntemleriyle (Well-Tempered Metadynamics, Umbrella Sampling) analiz edilmiş ve bağlanma süreçlerinin ayrıntılı mekanizması ortaya konmuştur. Bu kapsamlı moleküler analizler yalnızca toksinin doğal bağlanma dinamiklerini ortaya koymakla kalmamış, aynı zamanda toksini doğrudan hedef alan küçük moleküller ve peptidlerin tasarımına da zemin hazırlamıştır. Zengin moleküler kütüphanelerden seçilen potansiyel inhibitörler, sanal tarama ve farmakolojik filtreleme süreçlerinden geçirilmiştir. Bu moleküllerin toksinin işlevini engelleme potansiyeli, bağlanma enerjileri ve yapısal uygunlukları doğrultusunda değerlendirilmiştir. Özellikle tasarlanan siklik peptidlerin, toksinin bağlanma bölgelerinde yüksek stabilite ve afinite gösterdiği belirlenmiştir. Bu peptidlerin toksisite analizleri, in silico biyoinformatik araçlar (örneğin ToxinPred) kullanılarak yapılmış ve insan proteinleri ile düşük sekans homolojisi gösteren, toksik olmayan adaylar saptanmıştır. Bu durum, terapötik uygulamalarda bu peptidlerin olası yan etkilerinin düşük olacağını göstermektedir. Moleküler dinamik simülasyonları, bu peptidlerin toksinle oluşturduğu komplekslerin stabilite analizlerini doğrulamış ve bu yapıların hücresel ortamda etkin inhibisyon sağlayabileceğini ortaya koymuştur. Bu çalışmanın önemli bulgularından biri de, siklik peptidlerin toksini hem fiziksel olarak bağlayarak hem de UDP-glukoz bağlanma bölgesine müdahale ederek çift yönlü bir inhibisyon mekanizması sergilemesidir. Bu durum, toksinin işlevinin baskılanmasında etkili bir strateji olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, küçük moleküllerle peptidlerin karşılaştırmalı bağlanma enerjileri analiz edilmiş (MM-PBSA yöntemiyle) ve siklik peptidlerin bağlanma enerji profilinin oldukça olumlu olduğu gözlemlenmiştir. Bu da bu peptidlerin yüksek verimlilikte inhibitör adayları olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çalışmanın genel bulguları, toksin-hedefli tedavi yaklaşımlarının, özellikle yüksek nüks riski taşıyan ve antibiyotik direnci gelişmiş C. difficile enfeksiyonlarında alternatif tedavi stratejileri sunabileceğini göstermektedir. Mevcut antibiyotik tedavilerinin mikrobiyota üzerindeki olumsuz etkileri ve tekrar enfeksiyon riskleri göz önüne alındığında, toksin inhibisyonu enfeksiyonun etkilerini azaltmak için umut vadeden bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, bu in silico yöntemlerle elde edilen bulguların deneysel doğrulaması ve klinik öncesi testlerle desteklenmesi gereklidir. Tasarlanan moleküllerin hücre kültürü ve hayvan modellerinde etkinliği ve güvenliği ayrıntılı olarak değerlendirilmelidir. Bu süreç, ilaç geliştirme yolunda temel bir adımdır ve klinik uygulamalara geçiş için zorunludur. Ancak bu çalışma, moleküler düzeyde toksin etkileşimlerinin detaylı incelenmesi ve etkili inhibitörlerin rasyonel tasarımı açısından önemli bir başlangıç noktası oluşturmuştur. Sonuç olarak, bu tezde kullanılan ileri düzey moleküler modelleme, simülasyon ve sanal tarama tekniklerinin, ilaç keşif süreçlerini hızlandırma ve maliyetleri düşürme açısından büyük potansiyel taşıdığı gösterilmiştir. Ayrıca, toksin-hedefli inhibitörlerin geliştirilmesi, C. difficile enfeksiyonları ile mücadelede yenilikçi ve etkili tedavi alternatifleri sunma potansiyeline sahiptir. Gelecekte, bu yaklaşımların laboratuvar ve klinik uygulamalarla bütünleştirilmesi, enfeksiyon hastalıkları alanında önemli ilerlemelere katkı sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming bacterium re-sponsible for severe gastrointestinal infections that range from mild diarrhea to life-threatening conditions such as pseudomembranous colitis. These infec-tions primarily affect elderly and hospitalized patients, posing a significant health burden worldwide. Among the virulence factors, Toxin B (TcdB) plays a critical role due to its potent cytotoxic effects. Toxin B (TcdB) modifies host Rho and Ras family GTPases, selectively in their GDP-bound form, by glyco-sylation, disrupting the actin cytoskeleton, which leads to cellular damage and apoptosis. Current antibiotic treatments often result in high relapse rates and disrupt the gut microbiome, highlighting the need for alternative therapeutic strategies. Targeting TcdB directly represents a promising approach to miti-gate disease progression. This study employs computational techniques to de-sign small molecule inhibitors and therapeutic peptides that specifically in-hibit TcdB activity. Molecular docking, dynamics simulations, and binding energy calculations were utilized to explore the interactions between TcdB and host GTPases, as well as potential inhibitors. Enhanced sampling methods provided insights into the binding processes and complex stability. Virtual screening of extensive compound libraries identified candidates that bind ef-fectively to TcdB's active site. Furthermore, cyclic peptides engineered based on interaction hotspots showed strong binding affinity and stability, support-ed by toxicity prediction tools indicating low adverse effects. Comparative analyses suggest that cyclic peptides inhibit TcdB via a dual mechanism, not only by occupying the toxin's binding interface with the host GTPases but interfering also with the native UDP-glucose binding region. These findings support the development of TcdB-targeted therapies as viable alternatives to antibiotics in treating Clostridium difficile infections (CDI). Ex-perimental validation and in vivo studies remain essential for advancing these computational findings towards clinical application.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    752917

    Targeting bag-1S/C-raf interaction for therapeutic intervention in cancer

    Bag-1S/C-raf etkileşiminin kanserde terapötik bir yaklaşım olarak kullanılmak üzere hedeflenmesi

    ÖZGE TATLI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  2. Tez No

    755440

    Investigation of the effect of KX2-361 molecule on post-intoxication of Botulinum Neurotoxin Serotype A, using motor neurons differentiated from mouse embryonic stem cell line HBG3

    KX2-361 molekülünün Botulinum Nörotoksini Serotip A ile zehirlenme sonrası koşullara etkisinin HBG3 fare kök hücrelerinden farklılaştırılmış motor nöronlarda incelenmesi

    DİLARA KOÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ERKAN KİRİŞ

  3. Tez No

    313517

    Identification of putative protein kinase inhibitors acting on liver cancer cells

    Potansiyel protein kinaz inhibitörlerinin karaciğer kanserine karşı ilaç adayı olarak tanımlanması

    EBRU BİLGET GÜVEN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Tıbbi Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. RENGÜL ÇETİN ATALAY

  4. Tez No

    636315

    Sanal tarama ve çok boyutlu moleküler modelleme yöntemleri ile p53-MDM2 potansiyel inhibitörlerinin belirlenmesi

    Identification of p53-MDM2 potential inhibitors with virtual screening and multidimensional molecular modeling methods

    GÜLŞAH AYDIN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Biyofizikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MİNE YURTSEVER

    PROF. DR. SERDAR DURDAĞI

  5. Tez No

    805873

    Benzotiyazol türevi kalkonların sentezi, biyolojik aktivite, teorik hesaplama ve moleküler yerleştirme çalışmaları

    Synthesis, biological activity, theoretical calculation, and molecular docking studies of benzothiazole derivative chalcones

    AHMAD BADREDDIN MUSATAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    KimyaSakarya Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUSTAFA ZENGİN

    DOÇ. DR. ALPARSLAN ATAHAN

Geri Dön