Geri Dön

Lipozom-protoplastelektrofüzyon metodu ile aspergillus niger kökenli glikoamilaz geninin saccharomyces cerevisiae hücrelerine aktarılması ve ekspresyonu

Transfer and expression of aspergillus niger originated glucoamylase gene to saccharomyces cerevisiae using liposome-protoplast electrofusion method

  1. Tez No: 95548
  2. Yazar: GÖKHAN CORAL
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ÖMER ÇOLAK
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Electrofusion, Glucoamylase, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae. II
  7. Yıl: 2000
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Çukurova Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 128

Özet

öz DOKTORA TEZİ LİPOZOM - PROTOPLAST ELEKTROFÜZYON METODU ÎLE AspergiUmniger KÖKENLİ GLİKO AMİLAZ GENİNİN Saccharomyces cerevislae HÜCRELERİNE AKTARILMASI VE EKSPRESYONU GÖKHAN CORAL ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Yıl: 2000, Sayfa: 128 Jüri: Prof. Dr. Nedim UYGUN, Doç. Dr. Burhan ARIKAN, Doç.Dr. Sadık DİNÇER, Yrd. Doç. Dr. Nursel DOSTBİL Bu çalışmada, glikoamilaz aktivitesi yüksek olan Aspergillus niger Z10 doğal izolatından ekstrakte edilen total DNA'ların L-a-fosfatidil kolin 'den oluşturulmuş lipid vezikülleri içine sokulmasıyla elde edilen lipozomlann, Saccharomyces cerevisiae DC6 oksotrof mutantına ait protoplastlarla elektrofuzyonu sonucu anülolitik aktivite gösteren hibrit maya suşlanmn elde edilmesi amaçlanmıştır. Aspergillus niger ZIO izolatından kısmi olarak saflaştınlan amilaz enziminin Nişastah SDS Poliakrilamid Jel Elektroforezi analizleri sonucunda molekül ağırlığının yaklaşık 100.000 Dalton olduğu bulunmuştur. Elde edilen amilaz enziminin reaksiyon ürünleri kağıt kromatografisi ile analiz, edilmiş ve enzimin glikoamilaz olduğu anlaşılmıştır. Z10 Glikoamilaz enziminin optimal pH aralığının 4.5-5.5 ve sıcaklığa olan direncinin ise oldukça yüksek olduğu saptanmıştır. Elektroiüzyon deneylerinde prosesi optimize etmek için S. cerevisiae DC6 (MATa, leu2, his4) ve FY73 (MATa, ura3, his3) identik eşleşme tipine sahip oksotrof mutantlanndan elde edilen protoplastlar kullanılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda müspet sonucun 200 V/ınm şiddetinde, 2 MHz frekanslı alternatif akımda ve 8 kV şiddetinde, 1 msn uzunluğunda ve 5 saniye aralıklı 2 doğru akım pulsu uygulandığında alındığı saptanmıştır. Füzyon sonucu elde edilen hibrit maya hücreleri ile haploid parental suşlann DNA içerikleri mukayese edilmiş, hibritlerdeki DNA miktarının parental hücrelere oranla yaklaşık iki kat daha fazla olduğu bulunmuştur. A. niger Z10 nolu izolata ait kromozomal DNA'nın yüklenmiş olduğu lipozomlarla S. cerevisiae DC6 oksotrof mutantandan hazırlanmış protoplastlann elektrofuzyonu deneylerinde, biri paralel iki elektrottan, diğeri birbirine dik iki elektrottan oluşan iki farklı füzyon küveti kullanılmış ve elektriksel alan geometrisinin füzyon üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Her iki küvetle elde edilen deneyler sonucunda 7 adet füzant maya hücresine rastlanmıştır. Bu füzant hücreler daha sonra YPS agar besi yerine ekilerek glikoamilaz üretip üretmedikleri araştınlmışuT. Elde edilen sonuçlara göre her iki füzyon küvetiyle elde edilen 7 adet füzant maya susunda anülolitik zon görülmüştür. Elde edilen fuzanÜarla yapılan mikroskobik incelemeler sonucunda, hibrit maya hücrelerin morfolojik görünümlerinde kayda değer bir farklılığın bulunmadığı görülmüştür. Hibrit maya soslarından hazırlanan protein ömeüerinin poliakrilamid jeldeki separasyonu sonucunda kontrol olarak aynı jelde yürütülen parental DC6 susundan elde edilen proteinlerin profillerinden farklılık gösterdiği saptanmıştır. Hibrit maya hücrelerine ait örneklerde, parental DC6 susuna ait protein örneklerinde görülmeyen ve yaklaşık ağırlıkları 1 15.000, 100.000 ve 49.000 Dalton olan 3 farklı protein bandı saptanmıştır. Aynı jelin renatüre edilip iyodin boyası ile boyanması sonucunda, ağırlığı yaklaşık 100.000 Dalton olan bandın çevresinde anülolitik zonlann fark edilmesi bu protein fraksiyonunun Aspergillus niger orjinli olduğunu göstermiştir. Anahtar Kelimeler Elektrofüzyon, Glikoamilaz, Aspergillus niger, Sacctıaromyces cerevisiae. I

Özet (Çeviri)

ABSTRACT PhD THESIS TRANSFER AND EXPRESSION OP Aspergillus niger ORIGINATED GLUCOAMYLASE GENE TO Saccharomyces cerevisiae USING L1POSOM-PRO IOPL AS T ELECTROFUSION METHOD GÖKHAN CORAL DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor: Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Yean 2000, Pages: 128 Jury: Prof. Dr. Nedim UYGUN, Assoc Prof. Dr. Burhan ARIKAN, Assoc Prof.Dr. Sadık DİNÇER, Assist Prof. Dr. Nursel DOSTBİL In this study, it was aimed to achieve hybrid yeast strains showing amylolytic activity by electrofusion of protoplasts belonging to Saccharomyces cerevisiae DC6 auxotroph mutants and liposomes obtained by encapsulation of total DNA extracted from Aspergillus niger Z10 natural isolate with high glucoamylase activity into lipid vesicles made of L-a-Phosphatidyl coline. After the separation of the enzyme preparation from A. niger Z10 by Starch-SDS polyacrylamide gel electrophoresis, the approximate molecular weight of the enzyme was found as 100.000 Dalton. The reaction products of enzyme were analysed by descending paper chromatography and it was found that this enzyme is glucoamylase. In addition, the optimal pH range of the enzyme was found to be 4,5-5,5 and the thermal stability of this enzyme is quite high. Identic mating type of S. cerevisiae DC6 (MATa, leu3, his4) and FY73 (MATa, ura3, his3) protoplasts were used electrofusion experiments to optimize the process. Successful results were obtained with AC field of 200 V/mm, 2 MHz and a DC field of 2 exponential decay vaweform pulses (8 kV, 1 milisecond) at an interval of S second. The DNA content of hybrid yeast cells were compared with haploid parental strains and it was concluded that the DNA quantity of hybrid cells were about two fold higher than the parental strains. Two different fusion chambers were used in electrofusion experiments of A. niger Z10 DNA loaded liposomes and S. cerevisiae DC6 protoplasts which one chamber consists of two paraleli electrodes and the other consists of two perpandicular electrodes, and it was searched the effect of electrical field geometry on fusion chambers. 7 fusants were obtained by using both fusion chambers. These fusants were inoculated on YPS agar plates in order to understand whether they produce glucoamylase or not. According to the results, amylolytic zones were detected on YPS agar plates of all 7 fusants by using both fusion chambers. In microscobic observations of fusant cells, there were no important differences in the cell morphology of these hybrids. The total protein samples of the hybrid yeast cells and the parental strains were separeted togother by Starch-SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The different banding patterns were detected between the protein samples of the hybrids and the control parental DC6 strain. Three different bands which are not seen in the control parental strain were found in the protein samples of hybrid yeast cells. The molecular weight of these proteins were calculated as 115.000, 100.000 and 49.000 Dalton respectively. When the same gel was renaturated and stained with iodine solution, amylolytic zones were detected around the band that weights 100.000 Dalton. These findings were indicated that this protein fraction is Aspergillus niger originated.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    383000

    Celecoxib delivery with epidermal growth factor receptor-targeted immunoliposomes for cancer therapy

    Kanser tedavisi için anti-epidermal büyüme faktör reseptör hedefli immünolipozomlar ile Celecoxib salınımı

    YANUAR DWI PUTRA LIMASALE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. DİLEK KESKİN

    DOÇ. DR. SREEPARNA BANERJEE

  2. Tez No

    158362

    Nükleer görüntüleme teknikleri de kullanarak romatoid artrit tedavisinde diklofenak sodyum içeren ilaç taşıyıcı sistemlerin, konvansiyonel dozaj şekilleriyle etkinliklerinin karşılaştırılması

    Comparing the effectiveness of diclofenac sodium containing drug delivery systems in romatoid arthritis by using scintigraphic imaging techniques

    SELCAN TÜRKER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2004

    Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe Üniversitesi

    Radyofarmasi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. YEKTA ÖZER

  3. Tez No

    175155

    Dual action, photoactive liposomes as cancer drug carriers

    Kanser ilacı taşıyıcısı olarak etkili, fotoaktif lipozomlar

    ÖZLEM ÖĞÜN ÇİRLİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2002

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VASIF NEJAT HASIRCI

  4. Tez No

    756016

    Investigation of active microparticle motion at structured oil-aqueous interfaces and microcargo release via interfacial shear

    Yapılandırılmış yağ-su arayüzeylerinde aktif mikroparçacık hareketlerinin incelenmesi ve arayüzey kesme yoluyla mikrokargo salımı

    RAMAZAN UMUT DİNÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. EMRE BÜKÜŞOĞLU

  5. Tez No

    111393

    Derin ven trombuslarının teşhisi ve sintigrafik görüntülenmesi amacıyla geliştirilen ilaç taşıyıcı sistemler üzerinde in vitro ve in vivo çalışmalar

    In vitro and in vivo studies on drug delivery systems developed for diagnosis and scintigraphic imaging of deep vein thrombosis

    SUNA ERDOĞAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2001

    Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe Üniversitesi

    Radyofarmasi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. A. YEKTA ÖZER

Geri Dön