Yeşil floresan protein etiketli rekombinant antimikrobiyal peptid fermantasyon optimizasyonu ve biyoaktivitesinin belirlenmesi
Optimization of the fermentation and determination of the bioactivity of recombinant antimicrobial peptide tagged with green fluorescent protein
- Tez No: 965649
- Danışmanlar: DOÇ. DR. AHMET KATI, DR. ESRA AYAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Sağlık Bilimleri Üniversitesi
- Enstitü: Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 126
Özet
Antimikrobiyal peptidler, bakteriler, mantarlar ve bazı virüslere karşı geniş spektrumlu etki gösteren doğal biyomoleküllerdir. Artan antibiyotik direnci nedeniyle antimikrobiyal peptidler, alternatif antimikrobiyal ajanlar olarak büyük ilgi görmektedir. Hepcidin25, demir metabolizmasının kritik bir düzenleyicisi olup antimikrobiyal özelliklere sahiptir. Bu çalışmanın amacı, GFP etiketi ile izlenebilirliği artırılmış rekombinant GFP-Hepc25'in ekspresyon koşullarını optimize etmek, stabilitesini değerlendirmek ve antimikrobiyal etkinliğini belirlemektir. GFP-Hepc25 plazmidi tasarlanarak E. coli Rosetta (DE3) suşuna transformasyonu gerçekleştirildi. Üretim sıcaklık optimizasyonunun ardından, Biyolektör mikroölçekli fermentör kullanılarak IPTG konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve besiyeri bileşenleri optimize edildi. Peptidler FPLC ile saflaştırıldı ve saflaştırılan GFP-Hepc25 ile GFP etiketsiz Hepc25'in E. coli ve S. aureus'a karşı antimikrobiyal etkinliği MİK testi ile belirlendi. Peptidlerin ağır metaller, kimyasal ajanlar, sıcaklık, deterjan ve pH koşulları altındaki stabilitesi değerlendirildi. GFP-Hepc25'in optimum ekspresyonu 18°C'de, kazein, maya özütü ve NaCl içeren besiyerinde gerçekleşti. 0,1–1,0 mM IPTG konsantrasyonları arasında başarılı ekspresyon sağlandı. Stabilite testlerinde GFP-Hepc25'in 100°C'de 5 ve 10 dakika boyunca stabil kaldığı ancak uzun süreli yüksek sıcaklıkta yapısal bütünlüğünü kaybettiği gözlemlendi. MnCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, FeSO₄, CuSO₄, NaCl, asetik asit, benzoik asit, sodyum benzoat ve sodyum sülfat varlığında stabilitesini koruduğu belirlendi. Asidik pH değerlerinde stabilitesini koruyabildiği gözlemlendi. SDS, Triton-X100, Tween20 deterjanlarının varlığında ve alkali pH değerlerinde stabilitesini koruyamadığı belirlendi. GFP-Hepc25, S. aureus ve P. aeruginosa biyofilm oluşumuna karşı güçlü inhibisyon gösterdi. GFP-Hepc25, antibakteriyel etkinlik gösteren ve çevresel koşullara dirençli bir peptid olarak umut vadetmektedir. Bu çalışma, rekombinant AMP'lerin biyoteknolojik üretimi için bir model sunmakta ve GFP-Hepc25'in üretim verimliliğini artırmaya yönelik stratejilerin geliştirilmesine katkı sağlamaktadır.
Özet (Çeviri)
Antimicrobial peptides are natural biomolecules exhibiting broad-spectrum activity against bacteria, fungi, and certain viruses. Due to increasing antibiotic resistance, antimicrobial peptides have attracted considerable attention as alternative antimicrobial agents. Hepcidin25, a crucial regulator of iron metabolism, possesses inherent antimicrobial properties. This study aimed to optimize expression conditions, evaluate stability, and determine antimicrobial efficacy of recombinant GFP-Hepc25 with enhanced traceability through GFP tagging. The GFP-Hepc25 plasmid was constructed and transformed into E. coli Rosetta (DE3). Following temperature optimization, IPTG concentration, incubation time, and medium components were optimized using a BioLector micro-scale fermenter. Peptides were purified by FPLC, and antimicrobial activity of GFP-Hepc25 and untagged Hepc25 against E. coli and S. aureus was assessed via MIC assay. Stability was evaluated under various stressors: heavy metals, chemical agents, temperature, detergents, and pH conditions. Optimal GFP-Hepc25 expression occurred at 18°C in media containing casein, yeast extract, and NaCl. Successful expression was achieved with 0.1–1.0 mM IPTG. Stability tests revealed GFP-Hepc25 remained intact at 100°C for 5–10 minutes but degraded under prolonged heat. It maintained stability in the presence of MnCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, FeSO₄, CuSO₄, NaCl, acetic acid, benzoic acid, sodium benzoate, and sodium sulfate, as well as under acidic pH. However, stability was compromised by SDS, Triton-X100, Tween20, and alkaline pH. GFP-Hepc25 strongly inhibited S. aureus and P. aeruginosa biofilm formation. GFP-Hepc25 demonstrates antibacterial activity and high stability under various environmental conditions, making it a promising candidate among next-generation antimicrobial agents. This study provides a model for the biotechnological production of recombinant AMPs and contributes to developing strategies to enhance GFP-Hepc25 production efficiency.
Benzer Tezler
- Antimikrobiyal peptitlerin rekombinant olarak sentezi ve nanotaşıyıcı sistem enkapsülasyonu ile yara iyileştirme özelliklerinin incelenmesi
Synthesis of Antimicrobial Peptides Recombinantly and Investigation of Their Wound Healing Properties through Encapsulation in Nanocarrier Systems
BİLGE ÖLÇEROĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiSağlık Bilimleri ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AHMET KATI
DOÇ. DR. FIRAT BARIŞ BARLAS
- Schizosaccharomyces pombe'de bir otofaji modelinin oluşturulması
Construction of an autophagy model in Schizosaccharomyces pombe
VOLKAN SARI
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BEDİA PALABIYIK
- Investigation of gαi1 protein homodimerization in live cells using förster resonance energy transfer (FRET) and bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC)
G⍺i1 protein homodimerizasyonun canlı hücrelerde förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) metotları kullanılarak incelenmesi
ÖZGE ATAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON
DR. ÖĞR. ÜYESİ SALİH ÖZÇUBUKÇU
- A droplet-based platform for high throughput screening of drug administered cells
Damlacık tabanlı platformda ilaca maruz bırakılmış hücrelerin hızlı çıktı görüntülemesi
MÜGE KASIM
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞEFİKA KUTLU ÜLGEN
- Derin ötektik çözücüler ile fındık küspesinden protein ekstraksiyonu ve fındık proteinlerinin karakterizasyonu
Protein extraction from hazelnut meal and characterization of hazelnut protein
ESRA KİBAR BALBALLI
Yüksek Lisans
Türkçe
2025
Gıda MühendisliğiSakarya ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ GÜLŞAH KARABULUT