Sahadan izole edilen Pasteurella multocida serogrup B'ye karşı inaktif aşı geliştirilmesi
Developing an inactive vaccine against field-isolated Pasteurella multocida serogroup B
- Tez No: 973613
- Danışmanlar: PROF. DR. OSMAN ERGANİŞ, DOÇ. DR. ASLI BALEVİ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Selçuk Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Pasteurella multocida, Pasteurellaceae familyasından Gram-negatif bir kokobasil olup çiftlik hayvanlarında, özellikle de sığır ve koyunlarda ciddi enfeksiyonlara neden olmaktadır. Büyükbaş hayvan ölümlerinin yaklaşık % 20' sinden izole edilmektedir. Bu durum, hayvansal üretimi olumsuz yönde etkileyerek pek çok ülkede ciddi ekonomik kayıplara yol açmakta ve önemli bir sorun teşkil etmektedir. Fırsatçı patojen olup, sağlıklı hayvanların solunum yollarında saprofitik olarak bulunurlar. Konağın bağışıklık sistemi zayıfladığında hemorajik septisemi, tavuk kolerası, atrofik rinit, enzootik buzağı pnömonisi ve nakliye ateşi gibi ciddi durumlara yol açmaktadır. Bu çalışma, Pasteurella multocida ve virülans genlerinin karakterizasyonunu yapmak ve serogrup B'ye ait inaktif aşının farklı uygulama yolları ile immünojenitesini değerlendirmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Türkiye'nin farklı bölgelerinden laboratuvara teşhis amacıyla gönderilen/ getirilen, solunum yolu belirtileri gösteren sığır (n=130), koyun (n=70), keçi (n=45) ve evcil kuştan (n=5) toplam 250 örnek ile çalışıldı. Örneklerin 167'si, sığır (n=97), koyun (n=40) ve keçi (n=30) akciğerlerinden; geri kalanı (n=83) sığır (n=33), koyun (n=30) ve keçilerden (n=15) ve evcil kuşların (n=5) burun sürüntüsü olarak alındı. Primer izolasyon prosedüründe % 5 kanlı agar kullanılarak numunelerden etken izalosyonu yapıldı. Bakteriyolojik kültür sonucunda; izole edilen 27 adet (%8,4) P. multocida suşu PZR ile doğrulandı. PZR ile pozitifliği belirlenen P. multocida suşları; 19 farklı virülans geni (dış membran, fimbriae antijen genleri, somatik antijen genleri ve demir bağlama genleri) üzerinden PZR ile analiz edilerek tiplendirildi. Şüpheli P. multocida izolatları için kmt1 geni yönünden PZR yapıldı. Farklı kaynaklardan izole edilen suşların % 57,12'si sığır (12), %23,8'si koyun (5), %14,28'i keçi (3) ve % 4,8'i evcil kuşlardan (1) oluşmaktadır. Tiplendirme için önce kapsu genleri (cap B ve cap E) yönünden çalışıldı. Daha sonra plpB, tadD, gatG, hgbA, ompA, toxA, pcgD, latB, nctB, ppgB, natG, hgbB ve exbB genleri yönünden incelendi. İzolatların hiçbiri ompA, toxA, pcgD, latB, nctB, ppgB, natG, hgbB ve exbB'ye sahip değildi. Sığırlardan izole edilen iki cap B örneği virülans gen profili açısından birbirine benzerdi. Aday aşı bakteri suşu (CapB+, plpB+, tadD+, gatG+, hgbA+) BHI buyyonda 37 °C'de 48 saat inkübe edilerek yaklaşık 1×10⁹ cfu/ml bakteri yoğunluğunda üretildi. Kanlı agarlara ekim yapılarak saflık kontrolü yapıldı. Formalin (%0,05) ile inaktive edildikten sonra PBS ile santrijüj (20 °C'de 2000 × g'de 20 dakika) edilerek 3 kere yıkandı. Bakteri peleti, McFarland (No: 4) ile 1x109 cfu / 1 ml olacak şekilde PBS içinde yeniden süspanse edildi. Aday aşı, bakteri süpansiyonu (20 ml) ve Montanide ISA 206VG (Seppic-Fransa) adjuvanı (20 ml) ile homojenize edilerek hazırlandı. Hazırlanan aday aşı, farelere iki farklı aşılama yolu (subkutan-SC ve intramüsküler-IM) ile (0, 30 ml) uygulandı. Fareler 21 gün sonra tekrar aşılandı. Aşılı ve aşısız hayvanlardan 0., 21. ve 35. günlerde kan örnekleri alındı. Hayvan gruplarının seropotensi, indirekt ELISA testi (450nm) ile ölçüldü ve OD₄₅₀ verileri, kontrol grubu ile karşılaştırıldı. SC aşılama grubunda ortalama OD₄₅₀ değeri 0,575 bulunurken, IM aşılama grubunda OD₄₅₀ değeri 0,503 bulundu. Her iki grupta da cut-off değerin 0,323 civarındadır (Şekil 3.8). Beş hafta sonra, SC grupta yüksek antikor düzeyi (OD₄₅₀:1, 0961) korurken, IM grupta genel olarak antikor titrelerinde (OD₄₅₀: 1.042) daha hızlı bir artış görüldü. Elde edilen veriler varyans analizi ve Duncan'nın çoklu aralık testi (p<0.05) kullanılarak hesaplandı. Aşılı fareleri 1×108 (0.3 ml'lik enjeksiyon = 3×107/cfu) canlı patojen P. multocida serotip B ve serotip E suşları intraperitoneal yolla enjekte edilerek çelınç yapıldı. Serotip B ile çelınç yapılan farelerin tümü hayatta kalırken, serotip E ile çelınç yapılan farelerin tamamı 48 saat içerisinde öldüler. Bu çalışmada, P. multocida'nın diğer türlere kıyasla sığırlardan daha sık izole edildiği ve B serogrubu suşlarının daha az virülens genleri taşıdığı belirlendi. İnaktif P. multocida serogrup B aday aşısının, seropotens olarak iyi bağışıklık oluşturduğu, aşının serogrup E suşuna karşı koruma sağlamadığı çapraz korumanın olmadığı tespit edildi. Bu durum, daha geniş koruma için aşı formülasyonlarına birden fazla serogrubun dahil edilmesi gerektiğini düşündürmektedir.
Özet (Çeviri)
Pasteurella multocida, a Gram-negative coccobacillus from the Pasteurellaceae family, causes severe infections in farm animals, especially cattle and sheep. It is isolated in approximately 20% of cattle deaths. This situation adversely affects animal production, leading to significant economic losses in many countries and posing an important problem. It is an opportunistic pathogen and can be found as a saprophyte in the respiratory tract of healthy animals. When the host's immune system is weakened, it causes severe conditions such as hemorrhagic septicemia, fowl cholera, atrophic rhinitis, enzootic calf pneumonia, and shipping fever. This study was conducted to characterize P. multocida and its virulence genes and to evaluate the immunogenicity of an inactivated vaccine belonging to serogroup B via different administration routes. A total of 250 samples were collected from cattle (n=130), sheep (n=70), goats (n=45), and pet birds (n=5) showing respiratory symptoms, which were sent or brought to the laboratory from different regions of Turkey. Among these, 167 samples were from the lungs of cattle (n=97), sheep (n=40), and goats (n=30); the remaining 83 were nasal swabs from cattle (n=33), sheep (n=30), goats (n=15), and pet birds (n=5). In the primary isolation procedure, 5% blood agar was used to isolate the pathogen from the samples. As a result of bacteriological culture, 27 (8.4%) P. multocida strains were confirmed by PCR. PCR-positive P. multocida strains were analyzed and typed for 19 different virulence genes (outer membrane, fimbrial antigen genes, somatic antigen genes, and iron-binding genes). Suspected P. multocida isolates were tested for the kmt1 gene by PCR. Among strains isolated from different sources, 57.12% were from cattle (12), 23.8% from sheep (5), 14.28% from goats (3), and 4.8% from pet birds (1). For typing, capsule genes (cap B and cap E) were first examined. Subsequently, plpB, tadD, gatG, hgbA, ompA, toxA, pcgD, latB, nctB, ppgB, natG, hgbB, and exbB genes were analyzed. None of the isolates carried ompA, toxA, pcgD, latB, nctB, ppgB, natG, hgbB, or exbB. Two cap B samples isolated from cattle were similar in terms of virulence gene profiles. The candidate vaccine bacterial strain (CapB+, plpB+, tadD+, gatG+, hgbA+) was produced in BHI broth at 37 °C for 48 hours to approximately 1×10⁹ cfu/ml. Purity was checked by plating on blood agar. After inactivation with formalin (0.05%), the bacterial suspension was centrifuged (20 °C, 2000 × g, 20 minutes) and washed three times with PBS. The bacterial pellet was resuspended in PBS to 1×10⁹ cfu/ml using McFarland standard No. 4. The candidate vaccine was prepared by homogenizing the bacterial suspension (20 ml) with Montanide ISA 206VG adjuvant (20 ml, Seppic-France). The prepared candidate vaccine was administered to mice via two different routes (subcutaneous-SC and intramuscular-IM) at a dose of 0.3 ml. Mice were re-vaccinated 21 days later. Blood samples were collected from vaccinated and unvaccinated animals on days 0, 21, and 35. The seropotency of the animal groups was measured by indirect ELISA (450 nm), and OD₄₅₀ data were compared with the control group. The mean OD₄₅₀ value was 0.575 in the SC vaccination group and 0.503 in the IM group. In both groups, the cut-off value was approximately 0.323 (Figure 3.8). Five weeks later, the SC group maintained a high antibody level (OD₄₅₀: 1.0961), while the IM group showed a generally faster increase in antibody titers (OD₄₅₀: 1.042). Data were analyzed using variance analysis and Duncan's multiple range test (p<0.05). Mice were challenged via intraperitoneal injection with live P. multocida serotype B and E strains containing 1×108 LD₅₀ (0.3 ml injection = 3×107 cfu). All mice challenged with serotype B survived, whereas all mice challenged with serotype E died within 48 hours. In this study, P. multocida was found to be more frequently isolated from cattle compared to other species, and serogroup B strains carried fewer virulence genes. The inactivated P. multocida serogroup B candidate vaccine elicited good seropotency but did not protect against serogroup E, indicating the absence of cross-protection. These results suggest that inclusion of multiple serogroups in vaccine formulations is required for broader protection.
Benzer Tezler
- Dezenfektanların kanatlı ve balık bakteriyel patojenleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi
The investigation of the effects of disinfectants onto the bacterial pathogens of poultry and fish
ERTAN EMEK ONUK
- Petrol ile kirlenmiş sahadan izole edilen mikroorganizmaların PAH gideriminde kullanılabilirliğinin incelenmesi
Investigation of the PAH biodegradation potential of microorganisms isolated from petroleum-contaminated sites
HATİCE BİKE ULU
Doktora
Türkçe
2026
Çevre MühendisliğiOndokuz Mayıs ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMRE BURCU ÖZKARAOVA
DOÇ. DR. ALİ OSMAN ADIGÜZEL
- Koyun atıklarından izole edilen brucella melitensis suşlarının random amplifiye polimorfik DNA-PCR (RAPD) yöntemi ile genetik analizi
Genetic analysis of brucella melitensis strains isolated from aborted sheep by random amplified polymorphic DNA-PCR (RAPD) method
ZEKİ ARAS
Doktora
Türkçe
2009
Veteriner HekimliğiSelçuk ÜniversitesiVeterinerlik Mikrobiyolojisi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET ATEŞ
- Farklı su kaynaklarından izole edilen acanthamoeba türlerinin moleküler prevalansı ve genotiplerinin belirlenmesi
Molecular prevalance and genotyping of acantahamoeba species isolated from different water supplies
BURCU CENİKLİOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Veteriner HekimliğiErciyes ÜniversitesiVeterinerlik Parazitolojisi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ