CRISPR/CAS9-mediated HIS4 gene deletion in Pichia pastoris
Pichia pastoris'te CRISPR/CAS9 aracılı HIS4 geninin silinmesi
- Tez No: 974925
- Danışmanlar: PROF. DR. ŞERİF ŞENTÜRK, PROF. DR. MEHMET İNAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Biyoteknoloji, Genetics, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: CRISPR-Cas9 aracılı genom düzenleme, Komagataella phaffii, OPENPichia, suş geliştirme, CRISPR-Cas9-mediated genome editing, Komagataella phaffii, OPENPichia, strain development
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
- Enstitü: İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Pichia pastoris (Komagataella phaffii olarak da bilinir), rekombinant protein üretimi için yaygın olarak kullanılan bir konaktır. Ancak, birçok yüksek performanslı suş lisans kısıtlamalarına tabidir ve antibiyotik seçim belirteçlerine bağımlıdır; bu da düzenleme ve ölçeklenebilirlik sorunlarına yol açar. Bu çalışma, lisanssız OPENPichia kullanarak belirteç içermeyen K. phaffii suşları geliştirmeyi amaçlamıştır. HIS4 ve ADH2 genlerini yok etmek için CRISPR-Cas9 aracılı genom düzenleme kullanılmıştır. Elde edilen mutant suşlar daha sonra tescilli benzerleriyle karşılaştırılmıştır. Golden Gate Assembly tabanlı homolog rekombinasyon, iz bırakmayan genomik modifikasyonlara izin vererek genetik instabilite riskini en aza indirmiştir. HIS4 geninin tamamen silinmesi ve aktif bölgesinin yok edilmesi, istenmeyen genetik unsurlar eklemeden histidin oksotrofları üretmiş ve gelecekteki çok turlu mühendislik için oksotrof seçilimi mümkün kılmıştır. ADH2 geninin silinmesi, büyüme ve karbon kullanım oranıyla da doğrulandığı gibi, etanol kullanımını önemli ölçüde azaltmıştır. Karşılaştırmalı analizler, OPENPichia arka planındaki Δadh2 suşlarının ticarileştirilmiş benzerlerine kıyasla daha yüksek biyokütle verimleri ve büyüme hızlarını koruduğunu ortaya koydu ve bu da gelişmiş metabolik esnekliğe işaret ediyor. Rekombinant α-amilaz üretiminin SDS-PAGE analizi, etanol indüksiyon stratejilerinin verimi güçlü bir şekilde etkilediğini gösterdi; özellikle, Δadh2 suşları vahşi tip protein üretim kapasitesini aştı ve bu da daha yavaş etanol alımının, güvenlik ve süreç avantajları sağlamanın yanı sıra promotör indüksiyon verimliliğini de artırabileceğini gösteriyor. Endüstriyel bir bakış açısından, geliştirilen suşlar, tescilli suşların üretkenliğini lisanssız bir suşun düzenleyici ve operasyonel avantajlarıyla birleştiriyor. Bulgular, CRISPR-Cas9'u güçlü üretim suşları üretmek için hassas ve verimli bir araç olarak ortaya koyuyor ve hedefli metabolik mühendisliğin büyük ölçekli biyoproseslerde hem güvenliği hem de verimi artırma potansiyelini vurguluyor. Bu suşlar, tekrarlanan, belirteçsiz genomik modifikasyonlar gerektiren gelecekteki uygulamalar için çok yönlü bir platform sunuyor.
Özet (Çeviri)
Pichia pastoris (also referred to as Komagataella phaffii) is a widely used host for recombinant protein production. However, many high-performing strains are subject to licensing restrictions and rely on antibiotic selection markers, posing regulatory and scalability challenges. This study aimed to develop marker-free, K. phaffii strains using the license-free OPENPichia. CRISPR-Cas9-mediated genome editing was employed to knockout the HIS4 and ADH2 genes. The resulting mutant strains were then compared to proprietary counterparts. Golden Gate Assembly-based homologous recombination allowed scarless genomic modifications, minimizing the risk of genetic instability. Complete deletion and active-site knockout of HIS4 generated histidine auxotrophs without introducing unwanted genetic elements, enabling auxotrophic selection for future multi-round engineering. Deletion of ADH2 significantly reduced ethanol utilisation, as confirmed by growth and carbon utilisation rate. Comparative analyses revealed that Δadh2 strains in the OPENPichia background retained higher biomass yields and growth rates than their commercialised counterparts, suggesting enhanced metabolic flexibility. SDS-PAGE analysis of recombinant α-amylase production demonstrated that ethanol induction strategies strongly influenced yield; notably, Δadh2 strains exceeded wild-type protein production capacity, indicating that slower ethanol uptake may enhance promoter induction efficiency in addition to providing safety and process benefits. From an industrial perspective, the developed strains combine the productivity of proprietary strains with the regulatory and operational advantages of a license-free strain. The findings establish CRISPR-Cas9 as a precise and efficient tool for generating robust production strains and highlight the potential of targeted metabolic engineering to improve both safety and yield in large-scale bioprocessing. These strains represent a versatile platform for future applications requiring repeated, marker-free genomic modifications.
Benzer Tezler
- Modeling of the mechanism of the glucocorticoid resistance using CRISPR/Cas9 mediated genome editing
CRISPR/Cas9 genom değiştirme tekniği aracılığı ile glukokortikoid resistans mekanizmasının modellenmesi
AHSEN ÖZCAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
BiyolojiSabancı ÜniversitesiMoleküler Biyoloji, Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET BATU ERMAN
- Development and optimization of agrobacterium-mediated transformation method for CRISPR/Cas9-based genome editing in banana plant
Muz bitkisinde CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme için agrobacterium aracılı dönüşüm yönteminin geliştirilmesi ve optimizasyonu
BESTE GELSİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
BiyolojiÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CİHAN TAŞTAN
- Generation knock-in alleles by CRISPR/Cas9 mediated homologous recombination in Drosophila
Başlık çevirisi yok
ILGIM DURMUŞ
- CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak erkek kısır tütün (Nicotiana tabaccum) bitkilerinin geliştirilmesi
CRISPR-Cas9 mediated male sterility of Tobacco (Nicotiana tabaccum) by silencing acos gene
ŞAFAK ESRA ASLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSA KAVAS
- CRISPR-Cas9 aracılı PIK3CA gen modifikasyonunun kanser hücreleri üzerindeki terapötik etkilerinin araştırılması
CRISPR-Cas9 mediated PIK3CA modification as a novel treatment modality in cancer
ÖZGE SÖNMEZLER