Gıda endüstrisinde sorun yaratan patojen bakterilerin engellenmesi için yüksek hacimde faj üretiminin optimize edilmesi
Optimizing high-volume phage production to prevent pathogenic bacteria in the food industry
- Tez No: 1004886
- Danışmanlar: PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Gıda Mühendisliği, Biotechnology, Microbiology, Food Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Gıda kaynaklı patojen bakteriler (Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes ve Staphylococcus aureus vb.) heryıl binlerce enfeksiyona ve ekonomik kayba neden olduğu için küresel gıda güvenliği açısından büyük bir tehdit oluşturmaktadır. Bu nedenle geleneksel antimikrobiyal yaklaşımları tamamlayacak veya bu yaklaşımların yerini alacak yenilikçi, güvenilir biyokontrol yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Bakterileri lize eden virüsler olarak bilinen bakteriyofajlar, konakçı özgüllükleri, biyolojik kaynaklı olmaları ve litik kapasiteleri nedeni ile umut vaat edici bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır. Fajlar, gıda uygulamalarında yararlı mikroflorayı etkilemeden yalnızca zararlı mikroorganizmaları lize etmeleri, toksin kalıntısı bırakmamaları ve gıdanın duyusal özelliklerinde önemli bir değişiklik yaratmamaları gibi nedenlerden dolayı önemli avantajlar sunmaktadırlar. Antibiyotik direnci ile ilgili endişeler artmaya devam etmektedir. Bakteriyofaj bazlı ürünlerin kullanılmasına ilişkin düzenlemeler ile ilgilenen kurumlar, endüstri ve akademi tarafından giderek daha fazla ilgi görmekte ve ölçeklendirilebilir ve uygun maliyetli faj üretim teknolojilerinin geliştirilmesine duyulan önem artmaktadır. Endüstriyel uygulamalar (yüzey dekontaminasyonu, işleme sırasında biyolojik kontrol ve gıda ambalajlama vb.) genellikle yüksek oranda veya yüksek titrede bakteriyofaja ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle üretim yöntemlerinin optimzasyonu büyük önem taşımaktadır. Konakçı bakteri yoğunluğu, besiyeri bileşimi, sıcaklık ve inkübasyon süresi gibi işlem parametrelerinin optimize edilmesi, faj üretim verimini arttırmak ve maliyetleri düşürmek için oldukça önemlidir. Bu çalışmanın amacı bakteriyofaj üretiminin optimize edilmesi ve çeşitli dekontaminasyon uygulamaları ile patojen bakteri bulaşılarının önüne geçilmesidir. Bu amaçla öncelikle bakteriyofaj izolasyonu ve karakterizasyonu yapılmıştır. E. coli O157:H7 bakterisine spesifik fajlar izole edilmiş ve konakçı skalası çıkarılmıştır. Fajların E. coli bakterisine spesifik olduğu ve farklı türde bir bakteriyi enfekte etmediği görülmüştür. Daha sonra genomik materyal izolasyonu ve RFLP analizleri yapılmıştır. Burada fajların birbirlerinden farklı olup olmadığı araştırılmıştır. RFLP analizi ile birbirinden farklı olduğu belirlenen iki fajın (C1 ve F fajları) tek aşamalı gelişme eğrileri çıkarılmış ve adsorbsiyon katsayıları belirlenmiştir. Her iki faj için latent dönem süresi 15 dakika ve patlama büyüklükleri ise sırasıyla 150 ve 90 POB/hücre olarak belirlenmiştir. Fajların morfolojik karakterizasyonunun belirlenmesi için transmisyon elektron mikroskobu kullanılmıştır. Elde edilen görüntüler her iki fajında myovirüs morfotipine sahip olduğunu göstermiştir. Ek olarak CI ve F fajlarının uzunlukları sırasıyla 126 ve 136 nm olarak belirlenmiştir. Ardından fajların genomik analizleri yaplmış, genom haritaları oluşturulmuş ve filogenetik ağaç çıkarılmıştır. Ayrıca fajların CDS bölgeleri ve tRNA'ları belirlenmiştir. Gıdalarda faj uygulamalarında sıcaklık ve pH değerleri uygulamanın başarısı açısından önemli parametrelerdir. Bu nedenle fajların sıcaklık ve pH stabiliteleri belirlenmiştir. Fajların 60°C sıcaklıkta 1 saat inkübe edilmesinin ardından bile titrelerinde çok az düşüş olduğu gözlenmiştir. Ayrıca pH 4-11 aralığında fajların oldukça stabil olduğu ve pH 3 değerinde ise titrelerinin yaklaşık olarak yarıya düştüğü gözlenmiştir. Fajların bu sıcaklık ve pH aralıklarında bu kadar stabil olmaları gıda uygulamaları açısından önemli olarak değerlendirilmiştir. Farklı MOI değerlerinde litik aktivite de araştırılmıştır. Yüsek MOI değerlerinde litik aktivitenin iyi olduğu fakat zamana bağlı olarak dirençli bakterilerin oluştuğu gözlenmiştir. Gıda ve dekontaminasyon uygulamaları ise hem E. coli O157:H7 hem de Salmonella bakteri türleri için yapılmıştır. Tavukçuluk sektöründe kümeslerde meydana gelen Salmonella kontaminasyonları hem üretim hem de gıda güvenliği açısından önemli bir sorundur. Bu nedenle kümeslerde su, talaş (altlık materyali) ve plastik yüzeylerde faj kullanımı ile Salmoenlla dekontaminasyonu araştırılmıştır. Fajların su, talaş ve plastik yüzeylerde bakteri popülasyonunu azalttığı görülmüştür. E. coli O157:H7 için mantar gıda matriksi olarak seçilmiş ve faj uygulaması ile mantar üzerindeki bakteri sayısının takibi 4 ve 15°C değerlerinde gerçekleştirilmiştir. Mantar uygulamalarında 4°Cdeki litik etkinin 15°C göre daha az olduğu gözlenmiştir. Faj üretiminin optimizasyonu için besiyeri bileşimi ve çeşitli üretim parametreleri yanıt yüzey metodolojisi (RSM) yöntemi kullanılarak optimize edilmiştir. RSM deneyleri iki aşamalı olarak gerçekleştirilmiştir. Faj üretimini etkileyen etkili değişkenleri belirlemek ve optimum çalışma koşullarını saptamak için iki ayrı RSM optimizasyon çalışması yürütülmüştür. İlk RSM, faj verimi üzerindeki lineer, karesel ve etkileşim etkilerini değerlendirerek temel besin bileşenlerinin konsantrasyonlarını (karbon, azot ve mineral kaynakları) optimize etmek için uygulanmıştır. İkinci RSM çalışmasında ise sıcaklık, inkübasyon süresi ve karıştırma hızı dahil olmak üzere çevresel ve operasyonel parametrelerin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Belirlenen değişkenlerin, konakçı bakterinin metabolik aktivitesi ve fajın replikasyon dinamikleri üzerinde kritik bir etkiye sahip olduğu ortaya konmuştur. Verimli ve sürdürülebilir faj üretiminin sağlanabilmesi amacıyla optimum üretim koşulları; inkübasyon süresi 5,23 saat, karıştırma hızı 102 rpm ve inkübasyon sıcaklığı 39,36 °C olarak belirlenmiştir. Faj replikasyonunun verimliliğini düzenlemek için belirli MOI değerinde ve farklı inkübasyon sürelerinde denemeler yapılmıştır. Optimum üretim koşulları altında, faj titrelerinin (POB/mL) 60 dakika içerisinde yaklaşık 4 log artış gösterebildiği belirlenmiştir. Bu bulgular doğrultusunda, optimize edilmiş koşullar altında fajların kısa sürede yüksek miktarda üretimini mümkün kılan sistematik bir üretim yaklaşımı geliştirilmiştir.
Özet (Çeviri)
Foodborne pathogenic bacteria such as Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus pose a major threat to global food safety, as they cause thousands of infections and substantial economic losses every year. Therefore, there is a growing need to develop innovative, reliable, and sustainable biocontrol strategies that can complement or replace conventional antimicrobial approaches. Bacteriophages, which are viruses capable of lysing bacteria, have emerged as a highly promising alternative due to their host specificity, biological origin, and strong lytic capacity. In food applications, bacteriophages offer several advantages, including their ability to selectively target pathogenic bacteria without affecting beneficial microflora, leaving no toxic residues, and causing no significant alterations in the sensory properties of foods. Concerns related to antibiotic resistance continue to increase worldwide, leading to renewed interest from regulatory authorities, industry, and academia in phage-based products. As a result, the development of scalable and cost-effective bacteriophage production technologies has become increasingly important. Industrial applications such as surface decontamination, biological control during food processing, and incorporation into food packaging systems generally require bacteriophages at high concentrations or titers. Consequently, optimization of phage production processes is of critical importance. Process parameters including host bacterial density, culture medium composition, temperature, and incubation time must be carefully optimized to enhance phage yield while reducing production costs. The aim of this study was to optimize bacteriophage production and to evaluate the effectiveness of phages in preventing pathogenic bacterial contamination through various decontamination applications. Initially, bacteriophages specific to E. coli O157:H7 were isolated and characterized. Host range analyses demonstrated that the isolated phages were specific to E. coli and did not infect other bacterial species. Subsequently, genomic material was isolated and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses were performed to assess genetic diversity among the isolates. Two genetically distinct phages, designated C1 and F, were selected for further analysis. One-step growth curve experiments were conducted, and adsorption rate constants were determined. Both phages exhibited a latent period of 15 minutes, while burst sizes were determined to be 150 and 90 plaque-forming units per cell for phages C1 and F, respectively. Morphological characterization using transmission electron microscopy revealed that both phages belonged to the Myoviridae morphotype, with particle lengths of 126 nm for C1 and 136 nm for F. Genomic analyses were subsequently performed, including genome mapping, phylogenetic analysis, and identification of coding DNA sequences (CDSs) and tRNA genes. Since temperature and pH are critical parameters influencing the success of phage applications in food systems, the thermal and pH stability of the phages was also evaluated. Both phages remained highly stable after incubation at 60°C for 1 hour, showing only minimal reductions in titer. Moreover, the phages exhibited strong stability across a pH range of 4–11, while a reduction of approximately 50% in titer was observed at pH 3. This high level of stability under varying temperature and pH conditions is considered highly advantageous for food-related applications. The lytic activity of the phages was further investigated at different multiplicities of infection (MOI). Although high MOI values resulted in strong initial lytic activity, the emergence of resistant bacterial populations was observed over time. Phage-based decontamination applications were conducted for both E. coli O157:H7 and Salmonella spp. In the poultry sector, Salmonella contamination in poultry houses represents a major concern for both production efficiency and food safety. Therefore, the effectiveness of phage application for Salmonella decontamination was evaluated on water, litter (bedding material), and plastic surfaces commonly found in poultry environments. Phage treatment resulted in a significant reduction of bacterial populations on all tested surfaces. For E. coli O157:H7, mushrooms were selected as a food matrix, and bacterial reductions following phage application were monitored at 4°C and 15°C. The lytic activity observed at 4°C was lower compared to that at 15°C, indicating temperature-dependent phage efficacy. To optimize phage production, both culture medium composition and production parameters were optimized using Response Surface Methodology (RSM). The RSM experiments were conducted in two stages. The first RSM focused on optimizing the concentrations of key nutritional components (carbon, nitrogen, and mineral sources) by evaluating their linear, quadratic, and interaction effects on phage yield. The second RSM stage optimized environmental and operational parameters, including temperature, incubation time, and agitation speed. The results demonstrated that these variables play a critical role in host bacterial metabolic activity and phage replication dynamics. The optimal production conditions for efficient and sustainable phage production were determined as an incubation time of 5,23 hours, an agitation speed of 102 rpm, and an incubation temperature of 39,36°C. Additional experiments were conducted using defined MOI values and varying incubation durations to further regulate phage replication efficiency. Under optimized production conditions, phage titers (PFU/mL) were shown to increase by approximately 4 log units within 60 minutes. Overall, these findings demonstrate the successful development of a systematic and optimized production strategy that enables the rapid generation of high-titer bacteriophages suitable for food biocontrol applications.
Benzer Tezler
- Süt ve süt ürünlerinde sorunlara neden olan patojen Salmonella spp. ve psikrotrof Pseudomonas fluorescens suşlarının biyokontrolünde bakteriyofajların kullanımı
The use of bacteriophages for the biocontrol of pathogenic Salmonella spp. and psychrotrophic Pseudomonas fluorescens strains causing problems in milk and dairy products
EMİNE KÜBRA TAYYARCAN
Doktora
Türkçe
2023
MikrobiyolojiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSMAİL HAKKI BOYACI
- Evaluation of the use of niaouli volatile oil incorporated edible films as active food packaging for kashar cheese
Niaouli uçucu yağı ilaveli yenilebilir filmlerin kaşar peynirinde aktif gıda ambalajı olarak kullanımının değerlendirilmesi
ÖZDEN İLGÜZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NEŞE ŞAHİN YEŞİLÇUBUK
- Meyve sularında Bacillus cereus gelişiminin önlenmesi
Prevention of Bacillus cereus growth in fruit juices
ALİ ÖZGÜR ÖZCAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2005
Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NECLA ARAN
- Taze meyve ve sebzelerin ambalajlanmasında kullanılmak üzere poliüretan ve poliolefin bazlı çok katmanlı ve kompozit film üretimi
Produce multi-layered and composite films based on polyurethane and polyolefin for the packaging of fresh fruits and vegetables
TİLBE BENZER
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜRBÜZ GÜNEŞ