HIV-1 pozitif hastaların tam kan, lökosit ve plazma örneklerinde antiretroviral direnç ile ilişkili nükleik asit dizilerinin araştırılması
Investigation of nucleic acid sequences associated with antiretroviral resistance in whole blood, leukocyte and plasma samples from HIV-1 positive patients
- Tez No: 1013489
- Danışmanlar: PROF. DR. MEMNUNE SELDA ERENSOY
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Antiretroviral ajanlar, Direnç genleri, HIV, HIV I, HIV enfeksiyonları, Varyantlar, Anti-retroviral agents, Resistance genes, HIV, HIV I, HIV infections, Variants
- Yıl: 2026
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
AMAÇ: Bu çalışmanın amacı, HIV-1 pozitif hastaların tam kan, lökosit ve plazma örneklerinde antiretroviral direnç ile ilişkili nükleik asit dizilerini karşılaştırmalı olarak incelemek; farklı kompartmanlarda saptanan direnç ilişkili varyantların dağılımını, düşük frekanslı mutasyonları ve hasta içi viral popülasyon farklılıklarını ortaya koymaktır. Ayrıca, klasik konsensus temelli yaklaşımın ötesine geçilerek derin dizileme ile saptanabilen“quasispecies”(türümsü) olarak tanımlanan viral popülasyonların araştırılması ve bunların ilaç direnci ile ilişkisinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. GEREÇ ve YÖNTEM: Çalışmaya, aynı anda alınan kan örneğinden plazma, tam kan ve lökosit kompartmanı elde edilen 16 HIV-1 pozitif hasta dahil edildi. Plazmadan viral RNA; tam kan ve lökosit fraksiyonundan total nükleik asit izolasyonu yapıldı. HIV-1 pol gen bölgesi tek basamaklı RT-PCR ve“nested PCR”ile çoğaltıldı. Amplikonlar Illumina MiniSeq platformunda 2×150 bp“paired-end”formatında dizilendi. Konsensus düzeyindeki ilaç direnci mutasyonları SierraLocal/Stanford HIVdb ile, düşük frekanslı varyantlar“LoFreq”ile minimum 100× kapsam ve %2-20 varyant frekans aralığında değerlendirildi. APOBEC ilişkili G-A hipermutasyonu“Hypermut 3.0”ile araştırıldı. Haplotip rekonstrüksiyonu“CliqueSNV”ile yapıldı; kompartmantalizasyon TN93 tabanlı FST, Slatkin–Maddison ve Snn testleri ile incelendi. Filogenetik analiz maksimum olabilirlik yöntemiyle gerçekleştirildi. BULGULAR: Toplam 45 örnekten P07 lökosit ile P12 ve P14 plazma örnekleri başarısız amplifikasyon nedeniyle, P15 plazma örneği ise düşük“mapping”(haritalama) oranı (%0,39) ve yetersiz hedef bölge kapsamı (%23,18) nedeniyle dışlandı. Hedef bölge kapsam genişliği ortalama %99,5, ortalama derinlik 6.441× ve ≥100× kapsanan bölge oranı %97,2 bulundu. Konsensus düzeyinde sınırlı sayıda ilaç direnci mutasyonu saptanırken, düşük frekanslı varyant analizinde 16 hastanın 10'unda (%62,5) en az bir düşük frekanslı varyant saptandı. Kompartmanlar arası karşılaştırma, plazmada saptanmayan ancak hücresel DNA'da izlenebilen arşivlenmiş varyantların bulunabileceğini gösterdi. Diskordans analizinde tanımlanmış 25 mutasyonun 22'si (%88) diskordant (ayrışmış) olup en büyük bölümü lökosit kompartmanında saptandı. APOBEC hipermutasyon taramasında 93 testin yalnızca ikisi pozitifti ve her iki pozitiflik P06_WB örneğinde izlendi. Haplotip rekonstrüksiyonunda 44 örnekte toplam 515 haplotip tanımlandı; örnek başına ortalama haplotip sayısı 11,7, ortalama Shannon çeşitlilik indeksi 1,59 ve ortalama dominant haplotip frekansı 0,47 idi. Haplotip düzeyinde kompartmantalizasyon belirgindi. FST analizi kompartman çiftlerinin %73,7'sinde, Slatkin–Maddison testi hastaların %87,5'inde ve Snn testi %93,8'inde anlamlı bulundu. SONUÇ: HIV-1'de yalnızca plazma RNA konsensus genotiplemesine dayalı yaklaşım, düşük frekanslı ve kompartmana özgü direnç ilişkili varyantların önemli bir bölümünü gözden kaçırabilmektedir. Proviral DNA temelli analizler tamamlayıcı değer taşımakla birlikte, APOBEC ilişkili artefaktlar ve preanalitik değişkenlik nedeniyle dikkatli yorumlanmalıdır. Rezervuar ilişkili düşük frekanslı varyantların saptanabilmesi için varyant frekans eşiklerinin güvenli aralığa kadar düşürülmesi (%2-20) gerekmektedir. Sonuçların haplotip analizi, kompartmantalizasyon testleri ve tedavi öyküsü ile birlikte yorumlanması önemlidir. Prospektif, hasta sayısı artırılarak yapılacak çalışmalarla bu varyantların klinik etkisi doğrulanmalıdır.
Özet (Çeviri)
Objective: This study aimed to compare antiretroviral resistance-associated nucleic acid sequences in whole-blood, leukocyte, and plasma samples from HIV-1-positive patients. It also sought to characterize the distribution of resistance-associated variants across biological compartments, identify low-frequency mutations, and delineate intrapatient viral population heterogeneity. Beyond the conventional consensus-based approach, the study further investigated viral quasispecies detected by deep sequencing and evaluated their potential association with drug resistance. Materials and Methods: Sixteen HIV-1-positive patients were included, and plasma, whole-blood, and leukocyte samples were obtained simultaneously from a single blood draw. Viral RNA was extracted from plasma, whereas total nucleic acid was isolated from whole blood and the leukocyte fraction. The HIV-1 pol region was amplified by one-step RT-PCR followed by nested PCR, and the resulting amplicons were sequenced on the Illumina MiniSeq platform using 2 × 150 bp paired-end reads. Consensus-level drug resistance mutations were interpreted using SierraLocal/Stanford HIVdb, whereas low-frequency variants were analyzed with LoFreq using a minimum coverage threshold of 100× and a variant frequency range of 2%–20%. APOBEC-associated G-A hypermutation was assessed using Hypermut 3.0. Haplotype reconstruction was performed with CliqueSNV, and compartmentalization was evaluated using TN93-based FST, Slatkin-Maddison, and Snn tests. Phylogenetic analysis was performed using the maximum-likelihood method. Results: Of the 45 samples, the P07 leukocyte sample and the P12 and P14 plasma samples were excluded because of amplification failure, whereas the P15 plasma sample was excluded due to a low mapping rate (0.39%) and insufficient target-region coverage (23.18%). The mean breadth of coverage across the target region was 99.5%, the mean sequencing depth was 6,441×, and 97.2% of the target region was covered at a depth of at least 100×. Although only a limited number of drug resistance mutations were detected at the consensus level, low-frequency variant analysis identified at least one such variant in 10 of 16 patients (62.5%). Intercompartmental comparisons suggested the presence of archived variants that were undetectable in plasma but detectable in cellular DNA. In the discordance analysis, 22 of 25 identified mutations (88%) were discordant, with the largest proportion detected in the leukocyte compartment. APOBEC hypermutation screening yielded only two positive results among 93 tests, both in the P06_WB sample. Haplotype reconstruction identified a total of 515 haplotypes across 44 samples; the mean number of haplotypes per sample was 11.7, the mean Shannon diversity index was 1.59, and the mean dominant haplotype frequency was 0.47. Compartmentalization was prominent at the haplotype level: FST analysis was significant in 73.7% of compartment pairs, the Slatkin-Maddison test in 87.5% of patients, and the Snn test in 93.8%. Conclusion: Plasma RNA consensus genotyping alone may miss a substantial proportion of low-frequency and compartment-specific resistance-associated variants in HIV-1. Although proviral DNA-based analyses provide complementary information, they should be interpreted cautiously because of APOBEC-associated artifacts and preanalytical variability. Detection of reservoir-associated low-frequency variants may require lowering variant-frequency thresholds within an analytically reliable range of 2%–20%. The findings should be interpreted in conjunction with haplotype analysis, compartmentalization testing, and treatment history. Prospective studies in larger cohorts are warranted to clarify the clinical significance of these variants.
Benzer Tezler
- Talasemi majörlü olgularda lenfosit altgrupları ve immünglobülin düzeyleri
Lymphocyte subsets and immunglobulin levels in thalassemia major
BÜLENT ÖZGÖNENEL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1997
Çocuk Sağlığı ve Hastalıklarıİstanbul ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEMA ANAK
- HIV (İnsan immünyetmezlik virüsü) ile enfekte hastalarda antiretroviral tedavi sonrası laboratuvar parametreleri ve metabolik yan etkilerinin değerlendirilmesi
Evaluation of laboratory parameters and metabolic side effects after antiretroviral treatment in hiv (Human immunodeficiency virus) infected patients
ADİL CİHAN MUTLU
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiMarmara ÜniversitesiEnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ELİF TÜKENMEZ TİGEN
- Ankara ilindeki üç ilköğretim okulu öğrencilerinin epilepsiye yaklaşımı ve hastalık hakkındaki bilgi düzeyleri
Knowledge of epilepsy and attitudes towards the condition among three elementary schools students in Ankara
İKBAL OK BOZKAYA
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2006
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıGazi ÜniversitesiÇocuk Ruh Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞE SERDAROĞLU
- HIV pozitif hastalarda erken dönemde nefropatiyi göstermede sistatin C, KIM1 ve NGAl biyolojik göstergelerinin önemi
The importance of cystatin C, KİM1 and NGAl biological indicators in showing early nephropathy in hiv positive patients
DAMLA ERTÜRK
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2020
Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiÇukurova ÜniversitesiEnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLIHAN ULU
- Çocukluk çağı kronik karaciğer hastalıklarında endotelin 1 düzeyleri ve klinik önemi
Başlık çevirisi yok
NAFİYE DEMİRKIRAN URGANCI
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1997
Çocuk Sağlığı ve Hastalıklarıİstanbul ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜNGÖR T. TÜMAY
DOÇ. DR. FÜGEN ÇULLU