Geri Dön

Molecular dynamıcs analysıs of chk2 mutatıons at the C-lobe of the kınase domaın

Kinaz domaininin C-lobundaki chk2 mutasyonlarının moleküler dinamik analizi

  1. Tez No: 1015882
  2. Yazar: CİHAN UĞUR OTÇU
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. MERT GÜR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biyomühendislik, Biyofizik, Biotechnology, Bioengineering, Biophysics
  6. Anahtar Kelimeler: DNA hasarı, DNA onarımı, Kinazlar, Meme kanseri, Moleküler dinamik, Moleküler dinamik benzetimi, Moleküler modelleme, Mutasyon, Simülasyon, İşlemsel biyoloji, DNA damage, DNA repair, Molecular dynamic, Molecular dynamic simulation, Molecular modeling, Mutation, Computational biology
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Checkpoint kinaz 2 (CHK2), ökaryotik hücrelerde genom bütünlüğünün korunmasında kritik rol oynayan DNA hasar yanıtı (DNA damage response, DDR) ağının temel serin/treonin kinazlarından biridir. DNA'da oluşan özellikle çift iplik kırıkları (double-strand breaks, DSB) gibi ciddi hasarlar sonrasında, başta ATM (ataxia-telangiectasia mutated) olmak üzere hasar algılayıcı proteinler aracılığıyla aktive edilen sinyal iletim yolları hücre döngüsünün durdurulmasını, onarım mekanizmalarının devreye sokulmasını ve hasarın düzeltilemediği durumlarda senesens veya apoptoz gibi geri dönüşsüz süreçlerin başlatılmasını sağlar. CHK2 bu bağlamda, hücresel stres ve hasar sinyalinin“karar verme”basamaklarına aktarılmasında merkezi bir düğüm görevi görür. Bu nedenle CHK2 aktivitesinin doğru zamanda ve doğru düzeyde düzenlenmesi hem normal hücresel fizyoloji hem de kanserleşmenin önlenmesi açısından önem taşır. CHK2'yi kodlayan CHEK2 geninde çok sayıda varyant tanımlanmıştır ve bu varyantların bir kısmı farklı kanser türleri ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, klinik veri tabanlarında raporlanan mutasyonların önemli bir bölümü“belirsiz klinik öneme sahip varyant”(variant of uncertain significance, VUS) olarak sınıflandırılmaktadır; çünkü bu mutasyonların CHK2'nin yapısı, dinamikleri ve düzenlenmesi üzerindeki etkilerini açıklayan deneysel veya mekanistik kanıtlar sınırlıdır. Özellikle kinazlar gibi allosterik iletişimin güçlü olduğu proteinlerde, bir bölgede yer alan mutasyonların başka bir bölgede—örneğin düzenleyici bir loop üzerinde beklenmedik etkiler oluşturabildiği bilinmektedir. Bu tez çalışması, söz konusu belirsizliği azaltmayı hedefleyerek, seçilmiş kanserle ilişkili CHEK2 varyantlarının CHK2'nin atomik düzeyde yapısal dinamiklerini ve enerjetik/termodinamik davranışını moleküler dinamik (MD) simülasyonları üzerinden nicel olarak incelemektedir. Literatür taraması sonucunda, kolon/kolorektal kanser öyküsü bulunan bireylerde raporlanmış beş CHEK2 varyantı seçilmiştir: R318C, R318H, D438Y, R474H ve T476M. Bu mutasyonların tümü, CHK2'nin kinaz domeninin C-lob kısmında konumlanmaktadır. C-lob, katalitik çekirdeğin bir parçası olmasının yanı sıra substrat tanınması, katalitik döngülerin konumlanması ve düzenleyici bölgelerle (özellikle T- loop/aktivasyon segmenti) allosterik etkileşim açısından önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, C-lobda yer alan varyantların yalnızca yerel değişikliklere değil, aynı zamanda kinaz aktivasyonunu yöneten uzak bölgelerde de dinamik etkiler doğurması beklenebilir. Mutantlar arasında güvenilir karşılaştırma yapılabilmesi için, yapısal olarak eksiksiz bir CHK2 modeli oluşturulmuştur. Eksik bölgeler karşılaştırmalı modelleme ve hedefli moleküler dinamik yaklaşımlarıyla tamamlanmış; aktif duruma ilişkin T-loop segmenti, deneysel olarak çözümlenmiş aktif CHK2 yapısından yararlanılarak modele dahil edilmiştir. Katalitik bölgeye ADP ve Mg2+ eklenerek aktif bölgenin geometrik stabilitesi desteklenmiş; tüm sistemler açık solvasyon altında hazırlanmış ve çekirdeksel ortamı yaklaşık olarak temsil edecek iyon koşulları sağlanmıştır. Bu hazırlık, mutasyonların etkilerinin yalnızca başlangıç modeline özgü artefaktlardan değil, simülasyon boyunca örneklenen konformasyonel davranıştan kaynaklanmasını amaçlamaktadır. Yabanıl tip (WT) CHK2 ve her bir mutant için, aynı NPT koşulları altında iki bağımsız 300 ns'lik tüm atomlu MD simülasyonu gerçekleştirilmiştir. Bağımsız tekrarlar, gözlemlenen eğilimlerin tesadüfi bir trajektoriye bağlı olup olmadığını değerlendirmek açısından önemlidir. Her sistem için üç tamamlayıcı analiz yaklaşımı kullanılmıştır: (i) protein iskeletinin başlangıç yapısına göre küresel sapmasını değerlendiren RMSD (root-mean-square deviation), (ii) protein boyunca kalıntı bazında esneklik değişimlerini ortaya koyan RMSF (root-mean-square fluctuation) ve (iii) zaman serisi enerjilerindeki dalgalanmalardan türetilen, karşılaştırmalı bir enerjetik örnekleme ölçütü olarak kullanılan ısı kapasitesi (Cₚ) profilleri. Bu çoklu yaklaşım, yalnızca“ne kadar değişti?”sorusunu değil,“hangi bölgeler değişti?”ve“enerjetik olarak nasıl bir örnekleme davranışı sergiliyor?”gibi soruları da yanıtlamayı amaçlamaktadır. RMSD analizleri, WT ile karşılaştırıldığında D438Y, R474H ve T476M varyantlarının daha yüksek RMSD değerleri sergilediğini göstermiştir; bu durum, simülasyon boyunca başlangıç konformasyonundan daha belirgin bir konformasyonel uzaklaşmaya ve daha geniş bir yapısal örneklemeye işaret etmektedir. RMSD tek başına termodinamik“stabilite”yi doğrudan ölçmese de, aynı koşullarda gerçekleştirilen simülasyonlar arasında karşılaştırmalı olarak yorumlandığında, belirli mutasyonların CHK2'nin konformasyonel davranışını anlamlı biçimde değiştirebildiğini göstermektedir. RMSF analizleri, mutasyonların en dikkat çekici ortak etkisini ortaya koymuştur: Beş mutantın tamamında, CHK2'nin düzenlenmesinde kritik rol oynayan T- loop/aktivasyon segmentinde (S379–P393 aralığı) esneklik artışı gözlenmiştir. T-loop, kinazın aktif/inaktif konformasyonlar arasında geçişinde belirleyici bir düzenleyici bölgedir ve substrat bağlanması ile katalitik etkinlik açısından işlevsel önemdedir. Bu nedenle, C-lobdaki nokta mutasyonlarının T-loop dinamiklerini artırması, uzun menzilli allosterik iletişimin varlığına ve mutasyonların CHK2 regülasyonunu dolaylı biçimde etkileyebileceğine dair güçlü bir mekanistik ipucu sunmaktadır. Ayrıca A257–A264 bölgesini kapsayan αB–αC loop çevresi gibi diğer yapısal öğelerde de mutasyona özgü etkiler tespit edilmiştir. Özellikle R318C varyantında bu bölgede artmış dalgalanma gözlenirken, bazı diğer mutantlarda aynı bölgenin WT'ye göre daha düşük hareketliliğe sahip olduğu görülmüştür. Bu bulgular, her mutasyonun CHK2 üzerinde“tek tip”bir etki yaratmadığını; bazı mutasyonların belirli bölgeleri esnetirken bazılarının belirli bölgeleri rijitleştirebildiğini ortaya koymaktadır. Enerjetik analizlerde kullanılan Cₚ profilleri ise mutantlar arasında ayrışan örnekleme davranışlarına işaret etmiştir. Bununla birlikte, WT'nin iki bağımsız simülasyonu arasında Cₚ profillerinde belirgin farklılık gözlenmesi, sistemin enerjetik açıdan tam dengelenmeye (equilibration) henüz ulaşmamış olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, Cₚ profilleri bu tez kapsamında mutlak bir termodinamik“ısı kapasitesi”ölçümü olarak değil; daha çok sistemlerin enerjetik dalgalanma/örnekleme büyüklüklerini karşılaştırmalı olarak yansıtan bir gösterge olarak yorumlanmıştır. Bu çerçevede R318H varyantı, her iki trajektoride de daha düşük ve daha kararlı Cₚ davranışı sergileyerek daha sınırlı enerjetik dalgalanmalara ve potansiyel olarak daha dar konformasyonel örneklemeye işaret etmiştir. Buna karşılık bazı mutantlar (özellikle D438Y ve R474H) daha geniş veya zamanla artan dalgalanma profilleriyle ayrışmıştır. Sonuç olarak, bu tez çalışması, kinaz domeninin C-lobunda yer alan kanserle ilişkili CHEK2 varyantlarının, CHK2'nin yalnızca yerel yapısal özelliklerini değil; aynı zamanda uzak düzenleyici bölgelerin (özellikle T-loop) dinamiklerini ve sistemin enerjetik örnekleme davranışını da etkileyebildiğini göstermektedir. Elde edilen atomik düzeydeki bulgular, CHEK2 VUS'larının mekanistik yorumlanmasına yönelik nicel bir temel sağlamaktadır. Bu sonuçlar, gelecekte yapılacak daha uzun zaman ölçekli simülasyonlar ve tamamlayıcı biyokimyasal/hücresel deneyler (ör. kinaz aktivite ölçümleri, fosforilasyon belirteçleri ve DDR fenotipleri) ile birleştirildiğinde, hasta kaynaklı CHEK2 varyantlarının fonksiyonel sınıflandırılmasına ve kanser biyolojisindeki rollerinin daha net anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.

Özet (Çeviri)

Checkpoint kinase 2 (CHK2) is a central serine/threonine kinase in the DNA damage response (DDR), acting downstream of ATM to coordinate cell-cycle arrest, DNA repair, senescence, and apoptosis following genotoxic stress. Tight regulation of CHK2 activity is therefore essential for genome stability, and disruption of this regulation has been implicated in cancer predisposition and tumor progression. Consistent with this role, the CHEK2 gene harbors numerous cancer-associated variants, many of which are classified as variants of uncertain significance (VUS) due to the lack of mechanistic or structural interpretation. This thesis addresses this gap by investigating how selected cancer-associated CHEK2 substitutions perturb the structural dynamics and thermodynamic behavior of CHK2 at atomic resolution. Five CHEK2 variants reported in patients with a history of colorectal or colon cancer were curated from the literature and selected for detailed analysis: R318C, R318H, D438Y, R474H, and T476M. All substitutions are located within the C-lobe of the kinase domain (KD), a region critical for catalytic activity, substrate recognition, and allosteric communication with regulatory elements such as the T-loop. To enable a consistent and physically realistic comparison across variants, a structurally complete CHK2 model was constructed. Missing regions were rebuilt using comparative modeling and targeted molecular dynamics (MD) simulations, and the active-state T- loop segment was incorporated based on an experimentally determined active CHK2 structure. ADP and Mg2+ were included to stabilize the catalytic site, and all systems were solvated explicitly with ionic conditions chosen to approximate the nuclear environment. For the wild-type (WT) protein and each mutant, two independent all-atom MD simulation sets of 300 ns each were performed under identical NPT conditions using the CHARMM36 force field. Replicate simulations were used to assess the robustness and reproducibility of observed trends. Structural and energetic consequences of each substitution were quantified using three complementary metrics: root-mean-square deviation (RMSD) to assess global conformational drift, root-mean-square fluctuation (RMSF) to resolve residue-level flexibility changes, and heat capacity (Cₚ) calculated from energy fluctuations to probe mutation-dependent thermodynamic behavior. Relative to WT CHK2, D438Y, R474H, and T476M exhibited consistently higher RMSD values, indicative of increased conformational rearrangements and reduced structural stability. RMSF analysis revealed a striking common feature across all five mutants: enhanced flexibility within the T-loop region (S379–P393), a key regulatory segment that governs kinase activation and substrate access. This finding suggests that C-lobe substitutions can propagate long-range dynamical effects to distal regulatory elements, even when mutations are not directly located within the T-loop itself. In contrast, mutation-specific effects were observed in other regions. Notably, R318C showed elevated fluctuations in the αB–αC loop region (A257–A264), whereas several other mutants displayed reduced mobility in this segment compared with WT, highlighting mutation-dependent modulation of local rigidity and flexibility. Thermodynamic analysis further differentiated the variants. Heat-capacity profiles revealed distinct energetic sampling behaviors among mutants, reflecting altered access to conformational substates. In particular, R318H exhibited comparatively lower and more stable Cₚ values across both simulation sets, consistent with more confined energetic fluctuations relative to WT and other variants. Together with the structural analyses, these results underscore that different CHEK2 substitutions can influence CHK2 behavior through distinct yet overlapping dynamical and energetic mechanisms. Overall, this thesis demonstrates that cancer-associated CHEK2 variants located in the kinase C-lobe can induce long-range perturbations in both structural dynamics and thermodynamic properties, with pronounced effects on regulatory regions essential for kinase activation. By providing an atomistic and quantitative framework for interpreting mutation-induced changes in CHK2, this work contributes mechanistic insight into how patient-observed CHEK2 variants may modulate kinase regulation and function, and offers a foundation for future studies aimed at functional classification of CHEK2 VUS and their roles in cancer biology.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    962782

    Molecular dynamics simulations of chk2 kinase domain mutants

    CHK2 kı̇naz domain mutantlarının moleküler dı̇namı̇k sı̇mülasyonları

    EBRU TUNCAY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DOÇ. DR. MERT GÜR

  2. Tez No

    450963

    Molecular dynamics simulation analysis of His226 mutation on the dynamics of the ATPase domain of DNaK

    His226 mutasyonunun DNaK ATPaz domeni üzerindeki dinamiklerinin, moleküler dinamik simulasyonları ile analizi

    ELİF ÇAKMAK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

    YRD. DOÇ. DR. SEFER BADAY

  3. Tez No

    529051

    Molecular dynamics simulations and computational analysis of K-Ras4B and c-Raf interaction

    K-Ras4B ve c-Raf etkileşimlerinin moleküler dinamik simülasyonları ve hesaplamalı analizi

    AYŞE SEDA YAZGILI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEHRA ÖZLEM KESKİN ÖZKAYA

    PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY

  4. Tez No

    789424

    Comparative molecular dynamics analysis of a fungal hydrophobin roda behavior at interfacial environment

    Arayüz ortamında mantar hidrofobin roda davranışının karşılaştırmalı moleküler dinamik analizi

    İREM KARA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyoistatistikAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi

    Biyoistatistik ve Biyoinformatik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GÜNSELİ BAYRAM AKÇAPINAR

  5. Tez No

    461780

    A molecular dynamics analysis: Effect of colchicine on the activation of caspase-1

    Bir moleküler dinamik analizi: Kolşisinin kaspaz-1 aktivasyonu üzerindeki etkisi

    NERGİS GÜNİNDİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyomühendislikKoç Üniversitesi

    Kimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BURAK ERMAN

Geri Dön