Geri Dön

Molecular investigation of CHEK2 variants of unknown significance (VUS) found by genetic screening of breast and colorectal cancer patients and healthy individuals in Turkish population

Türk popülasyonunda meme ve kolorektal kanser hastaları ile sağlıklı bireylerde genetik tarama ile saptanan klinik önemi bilinmeyen CHEK2 varyantlarının moleküler incelemesi

  1. Tez No: 1018915
  2. Yazar: NİSAN DENİZCE CAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2026
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Kanser, etyolojisindeki biyolojik karmaşıklık, tanı ve tedavisindeki zorluklar ve giderek artan küresel insidansı nedeniyle 21. yüzyılın en önemli morbidite ve mortalite nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (IARC) tarafından yayımlanan son raporlar, kanser yükünün dünya genelinde endişe verici bir hızla arttığını; nüfus artışı, yaşlanma ve çevresel karsinojenlere maruziyet gibi risk faktörlerindeki değişimlerle birlikte 2050 yılı projeksiyonlarının özellikle sağlık altyapısı sınırlı olan gelişmekte olan ülkeler için ciddi bir kriz işaret ettiğini göstermektedir. Her ne kadar kanser vakalarının büyük çoğunluğu sporadik olarak gelişse de, yaklaşık %5-10'luk bir kesimin kalıtsal genetik yatkınlık zemininde ve yüksek penetranslı germ hattı mutasyonları etkisiyle ortaya çıktığı bilinmektedir. Bu kalıtsal yükün doğru tanımlanması, kişiselleştirilmiş tıp uygulamalarının temelini oluşturmakta; bireye özgü risk değerlendirmesi, erken tanı programları, koruyucu cerrahi seçenekleri ve inhibitör uygulamaları gibi hedefe yönelik tedavi stratejilerinin belirlenmesinde hayati bir rol oynamaktadır. Ancak, klinik pratiğe hızla giren yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri ve çoklu gen panelleri (MGPT), devasa veri setleri üretirken beraberinde önemli bir yorumlama krizini de getirmiştir. Klinik önemi belirsiz varyantlar (VUS) olarak adlandırılan ve hastalığa etkisi netleştirilememiş genetik değişimlerin sıklığı, özellikle Avrupa kökenli olmayan ve genetik veri tabanlarında yeterince temsil edilmeyen Türk popülasyonu gibi gruplarda çok daha yüksektir. Bu durum, genetik test sonuçlarının klinik belirsizliğe yol açmasına ve hasta yönetiminde aksamalara neden olmaktadır. Bu tez çalışması, söz konusu boşluğu doldurmak amacıyla, Türk popülasyonuna özgü geniş kapsamlı genetik tarama verilerini, laboratuvar temelli ileri fonksiyonel karakterizasyon çalışmalarıyla entegre eden bütüncül bir yaklaşım benimsemiştir. Çalışmanın temel amacı; Türk popülasyonundaki meme ve kolorektal kanser yatkınlık profilini netleştirmek ve bu taramalarda sıkça karşılaşılan ve klinik önemi belirsiz olan CHEK2 geni varyantlarının patojenitesini biyofiziksel ve hücresel yöntemlerle aydınlatmaktır. Çalışmanın epidemiyolojik ve klinik genetik temelini oluşturmak amacıyla, bugüne kadar Türk popülasyonu için gerçekleştirilmiş en kapsamlı vaka-kontrol serilerinden biri kurulmuştur. Çalışma kohortu, üç farklı sağlık merkezinden yönlendirilen toplam 2.569 katılımcıyı kapsamaktadır. Bu grup; klinik, patolojik ve aile öyküsü verileri detaylandırılmış 1.294 meme kanseri (MK) hastası, 370 kolorektal kanser (KRK) hastası ve kanser öyküsü bulunmayan 914 sağlıklı kontrol bireyinden oluşmaktadır. Hastalar, Ulusal Kanser Ağı (NCCN) kriterlerine göre yüksek riskli ve düşük riskli gruplara ayrılmıştır. Tüm katılımcılar, kalıtsal kanser yatkınlığı ile ilişkili 25 geni (ABRAXAS1, APC, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, MLH1, MRE11, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PALB2, PIK3CA, PMS2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, STK11, TP53, ve XRCC2) kapsayan yeni nesil dizileme tabanlı çoklu gen panelleri ile taranmıştır. Elde edilen ham veriler, ACMG/AMP kılavuzlarına uygun olarak optimize edilmiş biyoinformatik algoritmalarla analiz edilmiştir. Bununla birlikte, Türk popülasyonunun uluslararası veri tabanlarında (gnomAD, ClinVar) yetersiz temsil edilmesi nedeniyle, standart sınıflandırma protokollerine ek olarak; oluşturulan bu geniş kohorttaki alel frekansları referans alınmış ve varyant yorumlama kriterleri üzerinde popülasyona özgü iyileştirmeler uygulanmıştır. Genetik tarama sonuçları detaylandırıldığında, kohortta toplam 217 farklı patojenik veya muhtemel patojenik varyant (PV) ve 494 farklı VUS tanımlanmıştır. Meme kanseri hastalarında patojenik varyant taşıyıcılığı, klinik olarak yüksek riskli kabul edilen grupta %18,5 oranında saptanırken, düşük riskli grupta bu oran %7,0'a gerilemiş; ancak her iki oran da sağlıklı kontrollerdeki %4,1'lik taşıyıcılık oranının üzerinde kalmıştır. MK hastalarında en sık mutasyona uğrayan genler sırasıyla BRCA1 (%4,3), CHEK2 (%3,6), BRCA2 (%2,7), ATM (%1,4) ve PALB2 (%0,9) olarak belirlenmiştir. KRK hastalarında ise patojenik varyant sıklığı yüksek risk grubunda %24,7'ye ulaşmıştır. Bu grupta mutasyon yükünü sırasıyla MLH1 (%3,9), biallelic (çift alelli) MUTYH (%3,6), MSH2 (%2,7) ve CHEK2 (%1,9) genleri oluşturmuştur. Çalışma verileri, Türk popülasyonunda da evrensel genotip-fenotip korelasyonlarının geçerli olduğunu doğrulamıştır. Özellikle Üçlü Negatif Meme Kanseri (TNBC) hastalarında BRCA1 ve RAD51C patojenik varyantlarının istatistiksel olarak anlamlı düzeyde (sırasıyla p=0 ve p=0.0038) zenginleştiği; Mikrosatellit İnstabilitesi (MSI-High) gösteren kolorektal tümörlerde ise MLH1 ve MSH2 mutasyonlarının baskın olduğu (p=0.021 ve p=0.041) gösterilmiştir. Ayrıca, kohort içindeki Erkek Meme Kanseri (MBC) hastalarında CHEK2 ve BRCA2 mutasyonlarının varlığı, bu genlerin erkek hastalardaki risk değerlendirmesinde kritik olduğunu bir kez daha ortaya koymuştur. Tezin en çarpıcı çıktılarından biri, genetik varyantların zaman içindeki klinik yorum değişimini gösteren yeniden sınıflandırma reclassification analizleridir. 2020 yılında elde edilen ilk tarama verilerinin, 2025 yılı güncel veri tabanları ve popülasyona özgü frekansları ışığında yeniden değerlendirilmesi sonucunda, başlangıçta VUS statüsünde olan 494 varyantın %27,5'inin klinik sınıflandırması değişmiştir. Bu varyantların %23,6'sı (98 adet) zararsız veya muhtemel zararsız kategorisine gerileyerek klinik belirsizlikten kurtulmuş; %3,9'u (16 adet) ise patojenik veya muhtemel patojenik kategorisine yükselerek hastalar için tanı koydurucu hale gelmiştir. Kodlayan bölge uzunluğuna normalize edildiğinde, CHEK2 geninin hem PV hem de VUS yoğunluğu açısından Türk popülasyonunda en fazla varyasyon barındıran gen olduğu saptanmış, bu durum tezin ikinci aşaması olan moleküler karakterizasyon çalışmaları için CHEK2 geninin seçilmesinin temel dayanağını oluşturmuştur. Genetik tarama verilerinden hareketle, Türk popülasyonunda tekrarlayan sıklıkta görülen ancak klinik önemi belirsiz olan dört spesifik CHEK2 missense varyantı (FHA domaininde yer alan p.Leu183Phe ve p.Thr476Met; Kinaz domaininde yer alan p.Glu351Asp ve p.Ile160Met) derinlemesine fonksiyonel analizler için seçilmiştir. Bu varyantların yapısal etkilerini belirlemek amacıyla, mutant ve yabanıl tip cDNA dizileri pET30a vektörlerine klonlanmış ve rekombinant üretimi için E. coli BL21 (DE3) ekspresyon sistemi kullanılmıştır. Immobilize metal iyon kromatografisi (IMAC) ile protein saflaştırma prosesinin optimize edilmesinin ardından saflaştırılan yabanıl tip (WT) ve mutant proteinlerin ikincil yapıları, Dairesel Dikroizm (CD) spektroskopisi ile incelenmiştir. CD spektrumları, mutantların ikincil yapılarında WT'ye kıyasla majör bir bozulma olmadığını gösterse de, 20°C'den 90°C'ye kadar gerçekleştirilen termal erime analizleri kritik bir yapısal defekti ortaya çıkarmıştır. WT proteini 55°C ve 78°C'de iki aşamalı (bifazik) bir erime profili sergilerken; FHA domaininde yer alan p.Leu183Phe varyantı, 55°C'deki ilk erime geçişini tamamen kaybetmiş ve monofazik bir profil çizmiştir. Benzer şekilde p.Ile160Met varyantı da ciddi bir termal stabilite kaybı göstermiştir. Bu termodinamik instabilite, Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC-HPLC) ve sınırlı proteoliz deneyleriyle de teyit edilmiştir. SEC-HPLC analizlerinde mutantların (özellikle p.Ile160Met ve p.Glu351Asp) ATP varlığında dimerleşme eğilimlerinin arttığı, ancak p.Leu183Phe varyantının tripsine karşı aşırı duyarlı olduğu ve çok hızlı degrade olduğu gösterilmiştir. ATP ligandının varlığı, kinaz domain varyantlarını kısmen stabilize etse de, FHA domainindeki yapısal çöküşü kurtaramamıştır. Moleküler düzeyde saptanan bu biyofiziksel instabilitenin hücresel karşılığını görmek amacıyla MCF-7 meme kanseri hücre hattında geçici transfeksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. İmmünoblotlama sonuçları, p.Leu183Phe ve p.Ile160Met mutantlarının hücre içinde kararlı protein seviyelerine ulaşamadığını göstermiştir. Bu durumun mekanizmasını çözmek için yapılan deneylerde, hücrelerin proteozom inhibitörü MG-132 ile muamele edilmesi sonucunda p.Leu183Phe seviyelerinin belirgin şekilde arttığı gözlemlenmiştir. Bu bulgu, söz konusu varyantın yanlış katlanma nedeniyle hücrenin kalite kontrol mekanizması olan Ubikuitin-Proteozom sistemi tarafından tanınarak hızla yıkıma uğratıldığını kanıtlamaktadır. En çarpıcı bulgu olarak, p.Leu183Phe varyantının ayrılamayan bir hapsolmuş dimer formunda kaldığı; sağlıklı yabanıl tip proteinleri inaktif komplekslere hapsederek dominant-negatif bir etki gösterdiği saptanmıştır. Fonksiyonel açıdan bakıldığında, bu kararsız varyantları taşıyan hücrelerde DNA hasar yanıtı mekanizmasının çöktüğü saptanmıştır. Yabanıl tip Chk2, alt akış hedefleri olan p53 (Ser20) ve Cdc25C'yi (Ser216) etkin bir şekilde fosforile edebilirken; p.Leu183Phe ve p.Ile160Met mutantlarını eksprese eden hücrelerde p-p53 ve p-Cdc25C seviyeleri bazal düzeyde kalmıştır. MTT hücre canlılık testleri de bu bulguları desteklemiş; fonksiyon kaybı yaşayan mutantları taşıyan hücrelerin proliferasyon kapasitesinin düştüğü gözlenmiştir. Tüm bu veriler, ACMG kriterlerinin en güçlü kanıt basamağı olan PS3 kriterini (in vitro veya in vivo fonksiyonel çalışmalarda protein fonksiyonuna zarar verici etki) sağlamış ve FHA domeninde bulanan iki varyantların patojenik olarak sınıflandırılmasının önünü açmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışması, Türk popülasyonuna özgü en geniş kapsamlı genetik veri setlerinden birini literatüre kazandırırken, klinik genetik bulguları moleküler mekanizmalarla harmanlayan bütüncül bir bilimsel model sunmaktadır. Genetik tarama ile CHEK2 genindeki varyasyon yükü ve yeniden sınıflandırmanın önemi gösterilmiş; moleküler analizlerle p.Leu183Phe ve p.Ile160Met varyantlarının patojenitesi, termodinamik instabilite ve DDR çöküşü üzerinden kanıtlanmıştır. Bu bulgular, Türk hastalar için daha doğru bir genetik danışmanlık ve risk yönetimi imkanı sunarken, kişiselleştirilmiş tıp uygulamalarına katkı sağlamaktadır. Elde edilen sonuçlar, popülasyona özgü genomik verilerin fonksiyonel validasyonla desteklenmesinin, belirsiz genetik sonuçların çözümünde altın standart olduğunu ortaya koymaktadır.

Özet (Çeviri)

Cancer remains a leading cause of morbidity and mortality due to its biological complexity and increasing global incidence. According to the most recent global health statistics reported by the World Health Organization (WHO) and the International Agency for Research on Cancer (IARC), the cancer burden is rising at an alarming rate. Projections for 2050 signal a serious crisis, particularly for countries with limited healthcare infrastructure where access to advanced diagnostic tools is restricted. Although most cancer cases are sporadic, arising from somatic mutations accumulated over a lifetime, approximately 5–10% arise from hereditary genetic predisposition driven by high-penetrance germline mutations. Accurate identification of this burden is vital for personalized medicine, enabling tailored risk assessment, preventive surgical interventions, and early diagnosis. However, the integration of Next-Generation Sequencing (NGS) into clinical practice has introduced an interpretation crisis alongside the advantage of high-throughput data generation. The frequency of Variants of Uncertain Significance (VUS) is significantly higher in underrepresented groups like the Turkish population which are not adequately covered in global genomic databases such as gnomAD and ClinVar, leading to clinical uncertainty and difficulties in genetic counseling. To address this critical gap, this thesis adopts a holistic approach integrating large-scale population-specific genetic screening with in-depth functional characterization. The study aims to clarify breast and colorectal cancer predisposition in the Turkish population, establish a population-specific variant database to aid reclassification, and determine the pathogenicity of recurrent CHEK2 variants through biophysical and cellular assays.. A comprehensive case-control series was established, comprising 2,569 participants (1,294 breast cancer, 370 colorectal cancer, and 914 healthy controls) from three health centers in Istanbul. All participants were screened using NGS-based multigene panels covering 25 genes associated with hereditary cancer predisposition. When the genetic screening results were detailed, a total of 217 distinct Pathogenic or Likely Pathogenic Variants (PV) and 494 distinct VUS were defined. In breast cancer patients, pathogenic variant carriership was 18.5% in the high-risk group and 7.0% in the low-risk group, both exceeding the rate in healthy controls. The most frequently mutated genes in BC patients were BRCA1, CHEK2, BRCA2, ATM, and PALB2. In CRC patients, pathogenic variant frequency reached 24.7% in the high-risk group, driven primarily by MLH1, MUTYH (specifically biallelic mutations), MSH2, and CHEK2. The study confirmed universal genotype-phenotype correlations in the Turkish population; BRCA1 and RAD51C variants were enriched in triple-negative breast cancer (TNBC), while MLH1 and MSH2 mutations dominated in colorectal tumors showing high microsatellite instability (MSI-H). Additionally, CHEK2 and BRCA2 mutations were critical in male breast cancer risk assessment. A striking output was the reclassification analysis. Re-evaluating 2020 screening data against 2025 databases changed the clinical classification of 27.5% of VUS. Notably, 23.6% were downgraded to benign, resolving clinical uncertainty, while 3.9% were upgraded to pathogenic, becoming diagnostic. Normalized to coding region length, the CHEK2 gene harbored the most variation in the Turkish population, forming the basis for the molecular characterization studies in the second phase. Based on screening data, four CHEK2 missense variants (p.Leu183Phe, p.Thr476Met, p.Glu351Asp, and p.Ile160Met) seen at recurrent frequencies but with uncertain significance were selected for functional analyses. To assess the structural impact of these mutations, variants were recombinantly produced using the E. coli BL21 (DE3) expression system. Following the purification via immobilized metal ion chromatography (IMAC), the proteins were subjected to spectroscopic analysis. While Circular Dichroism (CD) showed no major secondary structure disruption in terms of alpha-helix and beta-sheet content, thermal melting analyses revealed critical defects. Unlike the wild-type (WT) protein, the p.Leu183Phe variant in the FHA domain lost the initial melting transition, and p.Ile160Met showed serious thermal instability. SEC-HPLC and limited proteolysis confirmed that while ATP binding partially stabilized kinase domain variants, it could not rescue the FHA domain structural collapse. To observe the cellular counterpart of this instability, transfection studies were conducted in MCF-7 cells. Immunoblotting showed that p.Leu183Phe and p.Ile160Met mutants failed to reach stable protein levels under basal conditions. Treatment with the proteasome inhibitor MG-132 significantly increased p.Leu183Phe levels, proving that these misfolded variants are rapidly degraded by the Ubiquitin-Proteasome system. Crucially, the p.Leu183Phe variant was identified as a“trapped dimer”that fails to dissociate, exerting a dominant-negative effect by sequestering endogenous wild-type proteins into inactive complexes. Functionally, the DNA Damage Response (DDR) mechanism collapsed in cells carrying these variants; unlike WT Chk2, the mutants failed to phosphorylate downstream targets p53 at Ser20 and Cdc25C at Ser216. Cell viability tests confirmed reduced proliferation in these cells. These data met the ACMG PS3 criterion (strong functional evidence), allowing the classification of the FHA domain variants as pathogenic. In conclusion, this thesis presents a comprehensive model blending clinical findings with molecular mechanisms. Genetic screening demonstrated the CHEK2 variation burden and the importance of periodic reclassification; molecular analyses proved the pathogenicity of specific variants through thermodynamic instability and DDR collapse. These findings offer accurate genetic counseling for Turkish patients and lay the groundwork for precise risk managemet strategies in hereditary cancer emphasizing that population-specific genomic data coupled with functional validation is essential for resolving diagnostic ambiguities.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    608010

    Prostat kanseri ile ilişkili genlerin yeni nesil dizileme yöntemi ile incelenmesi: Biyoinformatik araçlar ve veritabanları

    Investigation of genes associated with prostate cancer bynext generation sequencing: Bioinformatics tools anddatabases

    ALİ YAVUZ ÇAKIR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    GenetikSüleyman Demirel Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ KUYAŞ HEKİMLER ÖZTÜRK

  2. Tez No

    962782

    Molecular dynamics simulations of chk2 kinase domain mutants

    CHK2 kı̇naz domain mutantlarının moleküler dı̇namı̇k sı̇mülasyonları

    EBRU TUNCAY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DOÇ. DR. MERT GÜR

  3. Tez No

    886226

    Over kanserli hastalarda vus varyantların klinik etkilerinin araştırılması

    Investigation of the clinical effects of vus variants in ovarian cancer patients

    IŞIL YILDIRIM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    GenetikKocaeli Üniversitesi

    Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NACİ ÇİNE

  4. Tez No

    697977

    Herediter meme kanseri olgularında hücre sinyal iletiminde görev alan genlerdeki varyasyon sıklıklarının belirlenmesi ve tümör gelişimine etkisinin araştırılması

    Determination of variation frequencies of genes involved in cell signal transduction and investigation of its effect on tumor development in hereditary breast cancer cases

    CANSU UĞURTAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    GenetikKocaeli Üniversitesi

    Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NACİ ÇİNE

  5. Tez No

    554821

    Fonksiyonel olmayan hipofiz adenomlarında moleküler mekanizmaların araştırılması

    Investigation of molecular mechanisms in nonfunctioning pituitary adenomas

    DERYA METİN ARMAĞAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MELEK ÖZTÜRK SEZGİN

Geri Dön