Transforme edici büyüme faktörü alfa(TGF-alfa)'nın değişik formülasyonlarının geliştirilmesi, in vitro ve in vivo değerlendirilmesi
Development of different formulations of transforming growth factor alpha (TGF-alfa), in vitro and in vivo evaluation
- Tez No: 123594
- Danışmanlar: PROF.DR. NEVİN ÇELEBİ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Eczacılık ve Farmakoloji, Pharmacy and Pharmacology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2002
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gazi Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 11236
Özet
187 G. ÖZET Yara iyileşmesi hücrelerin bölünmesi ve göçü, yeni damar oluşumu, hücreler arası matriks proteinlerin sentezi ve bağ dokusunun yeniden oluşumunu içeren kompleks bir biyolojik süreçtir. Büyüme faktörleri, doku iyileşmesi fazlarının başlatılmasında ve sürekliliğininde anahtar rol oynar. Transforme edici büyüme faktörü alfa (TGF-a), gastrointestinal sistemin mukozal hücrelerinin farklılaşmasında ve çoğalmasında önemli rol oynar. Mide mukozasında TGF-a'nın diğer etkileri, mide asit sekresyonunun azaltılması, çeşitli ülser yapıcı faktörlere karşı koruma ve mide mukus üretiminin uyarımıdır. Son zamanlarda, gastrointestinal sistem yaralarında, bu özellikleri nedeniyle dışarıdan TGF-a'nın kullanımı önem kazanmıştır. Bu çalışmanın amaçları. Gastrointestinal bölgede TGF-a'nın stabilitesini artıracak oral mikroemülsiyon ve lipozom formülasyonları geliştirmek,. TGF-a içeren bu formülasyonların oral uygulanmasının, gastrointestinal sistemin fizyolojik koşullarına ve mukozal (mide ve duodenum) TGF-a düzeylerine etkisini araştırmak,. Proteaz enzim inhibitörü (aprotinin) içeren mikroemülsiyonun TGF-a'yı gastrointestinal bölgedeki enzimatik aktiviteden koruyup korumadığını incelemek,. CLSM kullanarak, eksojen TGF-a'nın mide, duodenum, jejenum ve ileum dokularındaki endojen EGF reseptörlerine bağlanıp, bağlanmadığını gözlemek,. Mikroemülsiyon formülasyonu içinde oral uygulanan TGF-a'nın, sıçanlarda ASA ile oluşturulan mide ülseri üzerindeki iyileştirici etkinliğini saptamaktır. Mikroemülsiyon formülasyonları, yağ fazı olarak Labrafıl M 1944CS, surfaktan olarak Arlacel 186:Brij 35 (5:1), kosurfaktan ve su fazı olarak, absolu alkol ve bidistile su kullanılarak hazırlanmıştır. TGF-a (10 jıg/kg) sulu188 faza ilave edildi. Aprotinin (3000 KIU/mL) enzim inhibitörü olarak mikroemülsiyon formülasyonuna ilave edildi. Damlacık büyüklüğü, viskozite, yoğunluk, bulanıklık, refraktif indeks, faz ayrışması ve pH ölçümleri mikroemülsiyonu karakterize etmede kullanıldı. Mikroemülsiyonun tüm fizyolojik özellikleri, sistemde TGF-ct ve aprotinin yokken ölçüldü. Mikroemülsiyonun fiziksel stabilitesi farklı saklama koşulları altında (4°C, 25°C, 40°C) 12 ay süre ile saptandı. TGF-a'nın mikroemülsiyondaki stabilitesi 4°C'de üç ay, 25°C'de iki ay incelendi. TGF-a'nın miktarları radioimmunoassay (RIA) ile ölçüldü. TGF-a'nın mikroemülsiyondan in vitro salımı, 37.0±0.1°C'de pH 1.2 mide ortamında, Franz difüzyon hücresi kullanılarak incelendi. Lipozom formülasyonlarının hazırlanmasında dipalmitoil fosfotidil kolin ve kolesterol kullanıldı. Tabaka sayısı, partikül büyüklüğü ve büyüklük dağılım ölçümleri lipozomu karakterize etmede kullanıldı. TGF-a'nın tutunma oranı Lowry ve RIA yöntemleri ile ölçüldü. Çalışmada 200±20 g ağırlığındaki erkek Wistar sıçanlar kullanıldı. Her grupta 8-12 sıçan olmak üzere altı ana gruba (C, ME, TME, TAME, LP and TLP) ayrıldı. TGF-a'nın mide dokusunda en uzun kaldığı süreyi saptamak için immünohistokimyasal çalışmalar yapıldı. TGF-a veya TGF-a'ya ilave olarak aprotinin içeren mikroemülsiyonlar sıçanlara kanülle intragastrik olarak 10 ng/kg dozda uygulandı. Bazal mide asit sekresyonu (ıımol H+/30 min), birinci ve ikinci bazal pH, mide mukus sekresyonu (^g/ g doku), mide sıvısının total protein içeriği (mg protein /ml_) gibi fizyolojik parametreler ölçüldü. Mide ve duodenum mukozasındaki TGF-a düzeyleri de, büyüme faktörü için spesifik RIA kullanılarak ölçüldü. CLSM çalışmaları farklı segmentlerde TGF-a'nın reseptörlere bağlandığını saptanmak için yapıldı. Akut gastrik lezyonlar 150 mg/kg dozda ASA'nın 0.2 N HCI çözeltisi içinde intragastik (i.g.) olarak uygulanması ile oluşturuldu. TGF-a (10 jag/kg.gün"1) çözelti veya mikroemülsiyon formülasyonları içinde iki gün189 süreyle uygulandı. Bazal mide asit sekresyonu (jlütioI H+/30 min), birinci ve ikinci bazal pH, mide sıvısının total protein içeriği (mg protein /ml_), mide mukus sekresyonu (p,g/ g doku) ve ülser alanı (mm2) ölçüldü. Bütün deney gruplarında mide mukozasındaki değişimler histolojik olarak incelendi. Sonuçlar, mikroemülsiyon formülasyonunun fiziksel özelliklerinin farklı saklama sıcaklıklarında, 12 ay süreyle değişmediğini gösterdi (p>0.05). Sonuçlar, TGF-a'nın birinci derece kinetikle parçalandığını gösterdi. Aktivasyon enerjisi (Ea), 9.89 kcal/mol olarak hesaplandı. Mikroemülsiyondaki TGF-a'nın raf ömrü 4°C'de 23 gün olarak bulundu, in vitro salım çalışmalarına göre, mikroemülsiyondan TGF-a'nın salımı 6 saattte %59.7 olarak bulundu. Lipozomlar, partikül büyüklüğü ve tutunma oranı ile karakterize edildi. Lipozomların çok veziküllü veziküllerden (MW) meydana geldiği ve lipozomların partikül büyüklüğünün zamanla değiştiği görüldü. TGF-a'nın tutunma oranı RIA yöntemi ile %51.39±1.65 hesaplandı. Immunohistokimyasal çalışmalar, mide dokusunda TGF-a'nın en uzun kalış süresinin 90 dk. olduğunu gösterdi. TME ve TLP (TGF-a taşıyan mikroemülsiyon ve lipozom formülasyonları) uygulanan grupların bazal mide asit düzeyleri, kontrol mikroemülsiyon (ME) ve kontrol lipozom (LP) gruplannkinden daha düşük bulundu (p0.05). Benzer sonuçlar mide sıvısının total protein içeriğinde de görüldü (p>0.05). TME ve TLP gruplarının mide mukus sekresyonları, ME ve LP grupları ile karşılaştırıldığında belirgin olarak arttı (p0.05). TAME grubunun duodenumdaki TGF-a düzeyleri ME grupla karşılaştırıldığında belirgin olarak artmıştır (p0.05). Benzer sonuçlar ikinci bazal pH düzeylerinde de191 görülmüştür. Ü-TME ve Ü-TAME gruplarının ikinci pH ölçümleri, tedavisiz gruba (Ü-KHB) göre belirgin artmıştır (p
Özet (Çeviri)
192 H. SUMMARY Wound healing is a complex biologic process that involves migration and division of cells, neovascularization, synthesis of extracellular matrix proteins and remodeling of scar. Growth factors play key roles in initiating and sustaining the phases of tissue repair. Transforming growth factor alpha (TGF-oc), plays important roles in proliferation and differentiation of mucosal cells of the gastrointestinal tract. Other effects of TGF-a in gastric mucosa include inhibition of gastric acid secretion, protection against various ulcerogenic factors and stimulation of gastric mucous production. Recently, the use of exogenous TGF- a due to these properties plays important roles in gastrointestinal tract wounds. The objective of this study were;. to develop oral microemulsion and liposome formulations that will increase the stability of TGF-a in gastrointestinal tract,. to investigate the effects of oral administration of these formulations containing TGF-a on physiological conditions of gastrointestinal tract and mucosal (stomach and duodenum) TGF- a levels,. to examine the microemulsion containing protease enzyme inhibitor (aprotinin) to observe whether it prevents TGF-a from enzymatic activity in the gastrointestinal tract or not.. to observe whether exogen TGF-a binds to endogen EGF receptors in the stomach, duodenum, jejenum and ileum tissues or not, using confocal laser scanning microscopy (CLSM).. to determine ulcer healing efficiency of TGF-a, which was oral administration in microemulsion formulation, on gastric ulcer induced by ASA in rats. The microemulsion formulation were prepared using Labrafll M 1944CS, Arlacel 186:Brij 35 (5:1), absolute alcohol and bidistilled water as the oil phase,193 surfactant, co-surfactant and aqueous phase, respectively. TGF-a (10 ng/kg) was added into water phase. Aprotinin (3000 KlU/mL) was incorporated as enzyme inhibitors in the microemulsion formulation. The droplets size, viscosity, density, turbidity, refractive index, phase separation, and pH measurements were performed to characterize microemulsion. All physical characteristics of the microemulsion were measured when TGF-a and aprotinin were not present in the system. The physical stability of the microemulsion was determined under different storage conditions (4°C, 25°C, 40°C) during 12 months. The stability of TGF-a in microemulsion was also investigated at 4°C or 25°C for three and two months, respectively. Amounts of TGF-a were measured by radioimmunoassay (RIA). The in vitro release of TGF-a from microemulsion formulation was carried out using Franz diffusion cell in pH 1.2 gastric medium at 37.0±0.1°C. The liposome formulations were prepared using dipalmitoyl phosphotidyl choline and cholesterol. The bilayer number and particle size and size distribution measurements were performed to characterize liposome. Entrapment ratio of TGF-a was measured by Lowry and RIA methods. Male Wistar rats, weighing 200±20 g were used throughout the study. They were divided into six major groups (C, ME, TME, TAME, LP and TLP), including 8-12 rats. Immunohistochemical studies were performed in stomach to determine the longest duration time of TGF-a in the stomach tissue. The microemulsions containing TGFa or TGFa plus aprotinin, were administered intragastrically at a dose of 10 ng/kg with a cannula to rats. The physiological parameters such as basal gastric acid secretion (jimol H730 min), first and second basal pHs, gastric mucus secretion (pg/ g tissue), protein content in stomach fluid (mg protein /ml_) were determined. The stomach and duodenum mucosal TGF-a levels were also measured using RIA which is194 specific for the growth factor. CLSM studies were done to observe binding of TGF-a to receptors at different segments. Acute gastric lesions were produced by intragastric (i.g.) administration of ASA at 150 mg/kg in 0.2 N HCI solution. TGF-a (10 ng/kg per day) in solution or microemulsion formulations were administered intragastically for two days. Basal gastric acid secretion (fj.mol H+/30 min), first and second basal pHs, protein content in stomach fluid (mg protein /mL), gastric mucus secretion (\xg/ g tissue) and ulcer area (mm2) were measured. The changes in the stomach mucosa were histologically examined in all experimental animal groups. The results indicated that the physical characteristics of the developed microemulsion formulation, did not change under different storage temparatures during 12 months (p>0.05). The results show that TGF-a degrades via first order kinetics. The activation enegy (Ea) was calculated as 9.89 kcal/mole. The shelf life (tgo) of TGF-a in microemulsion was found to be 23 days at 4°C. According to the in vitro release study the release of TGF-a from microemulsion was found as 59.7% within 6 hours. Liposomes were characterized by particle size and entrapment ratio. It was observed that liposomes consisted of multi vesicular vesicles (MW), and the particle size of liposomes changed with time. Entrapment ratio of TGF-a was calculated as %51.39±1.65 using RIA methods. Immunohistochemical studies indicated that the longest duration time of TGF-a was 90 min in stomach tissue. The basal gastric acid levels of TME and TLP (microemulsion and liposomes containing TGF-a) treated groups were found to be lower than those of the control microemulsion (ME) and control liposomes (LP) treated groups, respectively (p0.05). Similar results were also obtained for total protein contents of stomach fluids (p>0.05). The gastric mucus secretions in TME and TLP treatment groups increased significantly compared to ME and LP groups (p0.05). TGF-a levels in duodenum of TAME treated group was increased significantly compared to ME group (p0.05). Similar results were also obtained for the second basal pH levels. In second pH measurements of Ü-TME and Ü- TAME groups were increased significantly compared to untreated (Ü-KHB) group (p
Benzer Tezler
- Epidermal büyüme faktörü alfa reseptörleri ve transforme edici büyüme faktörü alfanın insan ovaryumu gelişen folliküllerindeki dağılımının immünohistokimyasal olarak belirlenmesi
Determination of the distribution of epidermal growth factor receptors and transforming growth factor alpha in the follicles of growing human ovary by immunohistochemical methods
BEHİCE BAĞDAGÜL AYAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2001
MorfolojiGazi ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. DENİZ ERDOĞAN
- Akciğer kanserinde büyüme faktörleri
Growth factors in lung cancer
NUSRET ALP ONATASLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
BiyokimyaEskişehir Osmangazi ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF.DR. ÖZKAN ALATAŞ
- Involvement of serotonin in the development of cardiac remodeling
Kardiyak yeniden düzenlenimde serotoninin rolü
SAMİYE YABANOĞLU
- İnsan pulmoner fibrozisinde etkili uzun kodlanmayan RNA'ların in vitro modelde belirlenmesi
The determination of effective long non-coding RNA on human pulmonary fibrosis in an in vitro model
MERVE YILDIRIM
- İnsan A549 hücreleri metastazı üzerinde D vitamininin etkisi
Effect of vitamin D on metastasis of human A549 cells
GULNAR MAHMUDOVA
