Purification of glutathione S-transferases and genetic characterization of zeta isozyme from Pinus brutia, Ten
Pinus brutia, Ten.'den glutatyon S-transferazların saflaştırılması ve zeta izoziminin genetik karakterizasyonu
- Tez No: 167424
- Danışmanlar: PROF.DR. MESUDE İŞCAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Glutatyon S-transferazler, Zeta sınıfı GST'lerin gen sekansı, Saflaştırma, SDS-PAGE Elektoforez, Karakterizasyon vıı, Glutathione 5-transferases, Zeta class GSTs gene sequence, Purification, SDS-PAGE Electophoresis, Characterization. v
- Yıl: 2005
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 146
Özet
oz Pinus brutia, Ten.'den GLUTATYON S-TRANSFERAZLARIN SAFLAŞTIRILMASI VE ZETA İZOZİMİNİN GENETİK KARAKTERİZASYONU Öztetik, Elif Doktora, Biyokimya Bölümü Danışman: Prof. Dr. Mesude İşcan Ocak 2005, 146 Sayfa Glutatyon S-transferazlar (GST) dimerik konformasyona sahip, bir tripeptid olan glutatyonun iipofilik yapılardaki elektrofilik merkezlere nükleofilik olarak konjugasyonunu katalizleyen çok fonksiyonlu enzim grubudur. Birincil fonksiyonları ksenobiotiklerin ve endojenlerin detoksifikasyonlannda rol almalarıdır. Sitozolik GST 1er onbir sınıf altında toplanırlar; (A); Alfa, (M); Mu, (P); Pi, (S); Sigma, (T); Teta, (Z); Zeta, (F); Fay, (U); Tau, (B); Beta, (O); Omega and (L); Lambda. vıBu çalışmada, total RNA'lar Pinus brutia iğne yapraklarından izole edilerek, GST Zeta cDNA'sı RT-PCR metoduyla hazırlanmış, elde edilen gen 5' RACE (cDNA uçlarının hızlı çoğaltılması) metodu ile uzatılmış ve gen dizisi tayin edilmiştir. Bu sekanstan yola çıkılarak GST-Zeta'mn amino asit dizisi ve 226 amino asitten oluştuğu belirlenmiştir. Ayrıca Pinus brutia yapraklarından genomik DNA izole edilerek, PCR metodu ile çoğaltılmış, sekans tayini ve cDNA sekansı ile karşılaştırması yapılmıştır. Farklı ağaçlardaki GST-Zeta gen ekspresyonlan Northern blot metodu ile analiz edilmiş, içerdikleri tiol miktarları tayin edilmiş ve karşılaştırılmaları yapılmıştır. Buna göre, mRNA ekspresyonlan üç kat farklılık gösterirken, GSH miktarlarının yaklaşık 1.8 kat farklılık gösterdiği ve GST-Zeta ekspresyonlan ile GSH konsantrasyonlannın birbiriyle ilişkili olmadığı bulunmuştur. CDNB'e karşı aktivite gösteren GST'nin Pinus brutia iğne yapraklarından %1.95'lik ürün ve 15.45 kat saf olarak izolasyonu ve saflaştmlması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma protokolü sırasıyla Sephadex G-25, DEAE anyon değişim, S-hexylglutatyon afinite kolon kromatografisinden oluşmaktadır. Saflaştınlan numune CDNB'e karşı 2022 nmole/min/mg değerinde aktivite göstermiştir. Saflaştınlan iğne yaprak GST enziminin SDS-PAGE ile moleküler ağırlığı (Mr) 24.000 Da olarak bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT PURIFICATION OF GLUTATHIONE S-TRANSFERASES AND GENETIC CHARACTERIZATION OF ZETA ISOZYME FROM Pinus brutia, Ten. Öztetik, Elif Ph.D., Department of Biochemistry Supervisor: Prof. Dr. Mesude İşcan January 2005, 146 pages Glutathione S-transferases (GST, EC2.5.1.18) are a family of multifunctional, dimeric enzymes that catalyse the nucleophilic attack of the tripeptide glutathione (y- L-glutamyl-L-cysteinyl-L-glycine) on lipophilic ' compounds with electrophilic centres. The primary function of GSTs is generally considered to be the detoxification of both endogenous and xenobiotic compounds. Cytosolic GSTs have been grouped into eleven distinct classes as: (A); Alpha, (M); Mu, (P); Pi, (S); Sigma, (T); Theta, (Z); Zeta, (F); Phi, (U); Tau, (B); Beta, (O); Omega and (L); Lambda. IVin this study, the total RNAs from Pinus brutia needles were isolated, GST Zeta cDNA was prepared by RT-PCR, the length of the insert was elongated by applying 5' RACE (Rapid Amplification for cDNA ends) method and the identity of the insert was checked by sequencing. The amino acid sequence of GST-Zeta was deduced as composed of 226 amino acids. The genomic DNA was also isolated from Pinus brutia needles, amplified by PCR and sequenced, and compared to the sequence of cDNA. The expression level of GST-Zeta in individual trees of Pinus brutia were examined by Northern blot analysis, and compared to their thiol contents. The mRNA levels varied up to three-fold, whereas GSH amounts varied approximately 1.8 fold, and there were no correlation between the GST-Zeta expression and GSH concentration. GST enzyme with activity towards CDNB was isolated and purified from Pinus brutia. needles in 1.95 % yield with a purification factor of 15.45-fold. The purifîcation protocol included a sequential chromatography on Sephadex G-25 column, DEAE cellulose anion exchanger liquid chromatography column, and S- hexylglutathione agarose affinity columns. The purified GST showed specific activity tovvards CDNB as 2022 nmole/min/mg. The GST purified from needles had a molecular weight (Mr) value of about 24.000 which was confirmed by SDS-PAGE.
Benzer Tezler
- Characterization and portial purificationof sheep lung cytosolic glutathione-S-transferases
Koyun akciğer glutatyon S-transferazlarının karakterize edilmesi ve kısmen saflaştırılması
REZA FARZAD
Yüksek Lisans
İngilizce
1994
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUDE İŞCAN
- Isolation and immunologic characterization of theta class glutathione S-transferase GSTT2-2 from bovine liver
Sığır karaciğerindeki teta-sınıfı glutatyon S-transferaz: GSTT2-2'in izolasyonu ve immünolojik karakterizasyonu
SULTAN BELGİN İŞGÖR
Doktora
İngilizce
2004
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NURSEN ÇORUH
PROF. DR. MESUDE İŞCAN
- Characterization and partial purification of sheep kidney and liver cytosolic glutathione-s-transferases: A comparative study
Koyun böbrek ve karaciğer glutatyon s-transferazlarının karşılaştırmalı olarak karakterize edilmesi ve kısmen saflaştırılması
AWNİ ALİ ABU-HİJLEN
Yüksek Lisans
İngilizce
1993
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MESUDE İŞCAN
- Characterisation of glutathione S-Transferase activity in Turkhish red pine (Pinus brutia ten): Variation in environmentally cold stressed seedlings
Kızılçam bitkisinde glutatyon S-Transferaz enziminin karakterizasyonu: Soğuk stresi altındaki Kızılçam fidanlarında glutatyon S-Transferaz enzim aktivitesindeki varyasyonlar
SEYHAN BOYOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUDE İŞCAN
UZMAN ZEKİ KAYA
- Glutatyon-s-transferaz enziminin tavuk eritrositlerinden saflaştrılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of GST from chicken erythrocyte
DEMET KAVRAYAN