Regeneration of lentil (Lens culinaris Medik) and genetic transformation by using Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer
Mercimek (Lens culinaris Medic) bitkisinin rejenerasyonu ve Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile genetik transformasyonu
- Tez No: 176712
- Danışmanlar: PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM, YRD. DOÇ. DR. FATMA YEŞİM EKİNCİ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2008
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 149
Özet
Bu çalışmada farklı bitki büyüme düzenleyicilerinin çeşitli mercimek eskplantlarının doğrudan ve dolaylı organogenez ile, kallus ve hücre sıvı kültürlerinden somatic embriyogenez yoluyla rejenerasyonu üzerindeki etkileri incelenmiştir. Uzunlamasına kesilmiş embriyonik eksen bölgeleri ve epikotil üzerindeki nodal bölgelerden düşük oranda sürgün gelişimi elde edilmiş ancak bütün bitki eldesi sağlanamamıştır. Dolaylı organogenez için sağlanan koşullar hipokotillerde şişme, internodların kök uçlarında ve yapraklarda zayıf kallus oluşumu sağlamıştır fakat bunu dokuların ölümü izlemiştir. Somatik embriyogenez çalışmalarında boylamasına kesilmiş embriyonik eksen ve çenek petiollerinden 0.75mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA eklenmiş Gamborg vitaminli MS besi yeri üzerinde yumuşak ve kırılgan kalluslar elde edilmiştir. Eksplant başına en yüksek ortalama embriyo sayısı, 12.36, 0.75mg/L BA +0.5mg/L 2,4-D içeren besi yeri üzerinde kültüre alınan çenek petiollerinde görülürken, 3mg/L BA+1mg/L NAA, iki eksplant için de bir ölçüde embriyo gelişimine izin veren tek hormon kombinasyonu olmuştur. Somatik kalluslar küresel embriyoların oluşumuna ve gelişimine rağmen rejenere olmayı başaramamıştır.Sonikasyon uygulamasının çenek boğumları, yarım çenekler ve bütün gövdeli çenek boğumu explantlarının Agrobacterium aracılığıyla taransformasyonuyla birleştirilmesi, eksplantlar üzerindeki geçici gus geni ifadesinde hiç bir geliştirici etki oluşturmamıştır. Sonikasyon uygulaması petiol eksenlerinde lokal yaralar oluşturulmasında da başarılı olmamıştır. Eksen bölgesinde en iyi gus geni ifadesi çenek boğumları ve KYRT1 suşunun vakum infiltrasyonu ve neşterle yaralama ile bir arada kullanılmasıyla elde edilmiştir. Dereceli seçilim ve rejenere olan sürgünlerin her seçilim döngüsünde uzaklaştırılması gus ifade eden sürgün sayısını önemli ölçüde arttırmıştır. Elde edilen sürgünler kök stoklarına aşılanarak sera koşullarında bütün bitki eldesi sağlanmıştır.Yapılan çalışmalarla etkili hale getirilen Agrobacterium aracılığıyla transformasyon protokolü kullanılarak % 2.3 transformasyon verimliliğiyle 4 bağımsız hat elde edilmiştir. Southern blot analizi gus geninin mercimek genomuyla bütünleştiğini kanıtlamıştır. T0 bitkileri verimlidir ve geni üç kopya olarak taşıyan bir hat dışında gus genini 3:1 Mendel ayrılma oranında sonraki nesillere aktarmışlardır. Ters ifadeli polimeraz zincir reaksiyonu, T0 ve T1 nesillerindeki gen ifadesini kanıtlamıştır. T0 bitkileri ve takip eden üç nesil gus genini tüm dokularında aynı biçimde ifade etmiş ve nesiller boyunca gus ve npt-II genlerinin PZR aracılığıyla çoğaltımı başarılı olmuştur.
Özet (Çeviri)
In this study, the effects of different plant growth regulators on regeneration responses of various lentil explants through direct and indirect organogenesis and through somatic embryogenesis from calli and cell suspension cultures were investigated. Shoot regeneration was obtained in low frequencies from longitudinal embryonic axis explants and nodal buds of epicotyls, however whole plant regeneration was unsuccessful. Conditions provided for indirect organogenesis resulted only in swelling of hypocotyls and root directed ends of internodes and weak callus formation on leaves which were followed by tissue browning and necrosis. In somatic embryogenesis studies, the explants longitudinal embryonic axis and cotyledonary petioles produced soft and friable calli on MS media with Gamborg?s vitamins supplemented with 0.75mg/L 2,4-D+0.5mg/L BA. The highest average number of embryos per explant, 12.36 was observed on media containing 0.75mg/L BA +0.5mg/L 2,4-D for cotyledonary petiole explants, whereas 3mg/L BA+1mg/L NAA was the only hormone combination that allowed embryo development to some extent, in both explants. Somatic callus failed to regenerate despite globular embryo formation and embryo development to some extent.Combination of sonication treatment with Agrobacterium transformation of three lentil explants; cotyledonary nodes, half cotyledons and cotyledonary nodes with intact shoots, had no effect on the improvement of transient gus gene expression on explants. Sonication treatment was also unable to form localized wounds on the petiole axils. The best gus gene expression on the axil region was obtained when cotyledonary nodes and KYRT1 strain were used in combination with vacuum infiltration and scalpel wounding of the axils. Gradual selection and repeated removal of regenerated shoots between selection cycles increased the number of gus expressing shoots significantly. The regenerated shoots were grafted on root stocks and whole plant regeneration was achieved in greenhouse conditions.By the use of the optimized Agrobacterium-mediated transformation protocol, 4 independent lines were obtained with 2.3% transformation efficiency. Southern blot analysis confirmed the integration of the gus gene into the genome of lentil plants. T0 plants were fertile and all plants showed Mendelian segregation of the gus gene in 3:1 ratio to their progenies except one line which carries three copies of the gene. Reverse transcription PCR has confirmed the expression of the genes in T0 and T1 generations. T0 plants and the following three generations strongly expressed gus gene uniformly in their tissues and the PCR amplifications of both gus and npt-II genes was successful through generations.
Benzer Tezler
- Optimisation of tissue culture conditions and gene transfer studies in lentil
Mercimekte doku kültürü şartlarının optimizasyonu ve gen transfer çalışmaları
MEHRZAD MAHMOUDİAN
Doktora
İngilizce
2000
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
PROF. DR. HALUK HAMAMCI
- Genetic transformation of lentil (Lens culinaris M. cv. Sultan.1) with a transcription factor regulator (MBF1c) and analysis of transgenic plants
Mercimeğin (Lens culinaris M. cv. Sultan.1) transkripsiyon faktör regülatör proteini (MBF1c) ile genetik transformasyonu ve transgenik bitkilerin analizi
HAMDİ KAMÇI
Doktora
İngilizce
2011
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiPROF. DR. MERAL YÜCEL
YRD. DOÇ. DR. UFK ÇELİKKOL AKÇAY
- Optimization of a regeneration and transformation system for lentil (Lens culinaris M.,cv.Sultan-I) cetyledonary petioles and epicoyyls
Mercimek kotiledon petiollerinde rejenerasyon ve transformasyon sistemlerinin optimizasyonu
ABDULLAH TAHİR BAYRAÇ
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
YRD. DOÇ. DR. FÜSUN İNCİ EYİDOĞAN
- Mercimek (Lens culinaris Medik)'te doku kültürü çalışmaları ve Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla gen aktarımı
Tissue culture and gene transfer by Agrobacterium tumefaciens in lentil (Lens culinaris Medik)
KHALİD MAHMOOD KHAWAR BHATTİ
- Optimisation of Agrobacterium mediated gene transfer and micrografting systems in lentil (Lens culinaris Medik)
Mercimekte (Lens culinaris Medik) Agrobakteri yoluyla gen transferi ve mikro aşılamaya dayalı rejenerasyon sistemlerinin optimizasyonu
HAMDİ KAMÇI
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
YRD. DOÇ. DR. FÜSUN İNCİ EYİDOĞAN
