Geri Dön

High resolution melting curve (hrm) analiz yönteminin delesyon tipi mutasyonlarin saptanmasinda kullanimi

High resolution melting curve (HRM) analysis technique for detection of deletion type mutations

PDF İndir

  1. Tez No: 195935
  2. Yazar: ASLI KUZPINAR
  3. Danışmanlar: PROF.DR. ŞÜKRİYE AYTER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
  6. Anahtar Kelimeler: DNA denatürasyonu, floresan işaretleme, DNA Tm derecesi, Real-time PZR, genetik test, DNA denaturation, fluorescent labeling, DNA Tm Degree, Real-time PCR, genetic test
  7. Yıl: 2007
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 73

Özet

Genetik hastalıkların klinik tanısının doğrulanması, genotip?fenotip ilişkisinin kurulması ve doğum öncesi tanı verilebilmesi için bu hastalıklara yol açan mutasyonların tanımlanması gereklidir. Bu nedenle, değişik mutasyon tarama yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemlerden biri de High Resolution Melting Curve (HRM) analizidir. HRM analizi DNA'nın sıcaklıkla denatürasyonunun floresan boya ölçümü ile takibi esasına dayanır, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)'nun yapıldığı tüpte, 10?15 dakika içerisinde gerçekleştiğinden diğer tarama yöntemlerinin yerini alabilecek niteliktedir. Tez çalışmasında, HRM analizinin delesyon tipi mutasyonları saptamadaki etkinliğinin araştırılması ve delesyon boyutu, DNA amplikon boyutu, GC içeriği, Mg2+ ve DNA konsantrasyonu, DNA thermal cycler cihazı ve floresan işaret veren boya gibi değişkenlerin HRM analizinin delesyonları saptama hassasiyetine olan etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, NF1 geni ekzon 4b'de bulunan 496delGT ve 499delTGTT; ekzon 12a'da bulunan 1758delTA; ekzon 22'de bulunan 3759delCTACC ve 3818delCT ve CFTR geni ekzon 10'da bulunan ?F508 mutasyonları incelendi. Çift zincirli DNA'ya bağlanma özelliğine sahip floresan boya olan SYTO9 varlığında PZR yapıldı ve yüksek çözünürlüklü DNA denatürayon eğrileri elde edildi. Heterozigot ve homozigot dizi farklılıkları normalize ve türev eğrilerin analiz edilmesiyle belirlendi. Mutasyon taşıyan örnekler, normal örneklerden eğrilerin şekline ve durumuna göre ayırt edildi. Çalışılan 4 ekzonda incelenen 6 delesyonun tümü saptandı. Amplikon boyutunun ve GC oranının arttığı ekzonlarda, kompleks eğriler oluştu. 2-8 ng/?l arasındaki DNA konsantrasyon değerlerinde HRM analizinin etkinliği değişmedi. Mg2+ konsantrasyonunun artması sonucunda Tm derecesinin arttığı belirlendi. DNA amplifikasyonun gerçekleştirildiği thermal cycler cihazının HRM analizi sonuçlarını değiştirmediği saptandı. Ayrıca, HRM analizi ile delesyon saptanmasında SYBR Green boyasının kullanılamayacağı belirlendi. Sonuç olarak, HRM analizinin delesyon saptamak için kullanılabilecek uygun bir yöntem olduğu gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

Detection of mutations in genetic diseases is important for the confirmation of clinical diagnosis, for the establishment of genotype-phenotype correlation and prenatal diagnosis. For that reasons, a variety of mutation scanning techniques have been developed. High Resolution Melting Curve (HRM) analysis is one of these techniques. It is based on the measurement of fluorescent dye during thermal DNA denaturation. Mutation detection takes place in the same reaction tube as the amplification and it takes only 10 ? 15 minutes, therefore it may replace the other scanning methods. In this thesis, our aim is to search efficiency of HRM analysis for the detection of deletion type mutations, and define the parameters such as deletion size, DNA amplicon size and GC content, Mg2+ and DNA concentration, type of DNA thermal cycler machine and flourescent dye which can affect HRM analysis. For this purpose, we investigated the mutations in the NF1 gene which are 496delGT and 499delTGTT (exon 4b), 1758delTA (exon 12a), 3759delCTACC and 3818delCT (exon 22) and ?F508 (exon 10) mutation in the CFTR gene. PCR was performed in the presence of the double stranded DNA binding dye SYTO9 and highresolution melting curves were obtained. Heterozygous and homozygous sequence variations were analyzed from normalized and derivated graphs. Mutant genotypes were distinguished from the wild-type in terms of melting curve shape and position and all of 6 deletions were detected. However complex curves are obtained for the large amplicons because of the increased amount of the GC domains. The efficiency of HRM analysis did not change in DNA concentrations between 2-8 ng/?l. It was determined that Tm degree increases with increasing amount of Mg2+ concentrations. The type of PCR equipment where the DNA amplifications were performed did not change the results of HRM analysis. Also, it was determined that SYBR Green dye can not be used for detection of the deletions with HRM analysis. In the light of these results, HRM analysis can be used to detect deletion type mutations and as a prescreening test for unknown mutations.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    476251

    Yöresel peynirlerden izole edilen laktik asit bakterilerinin real-time PCR yüksek çözünürlüklü erime (RT-PCR-HRM) analizi ile karakterizasyonu

    Characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional cheeses with real-time PCR high resolution melting (RT-PCR-HRM) analysis

    ALAEDDİN TÜRKMEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyoteknolojiErciyes Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN

  2. Tez No

    387437

    Süt ürünleri ve zeytinde bozulmaya neden olan maya türlerinin 'real-time PCR yüksek çözünürlüklü erime analizi' ile tanımlanması

    Identification of spoilage yeasts in dairy products and olives with real-time PCR high resulotion melting analyses

    MİNE ERDEM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyoteknolojiErciyes Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN

  3. Tez No

    505702

    Lactobacillus cinsi bakterilerin tanımlanmasına yönelik yöntem geliştirilmesi

    Development method for identification of Lactobacillus species bacteria

    ÖZGE KILIÇ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Gıda MühendisliğiErciyes Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZÜLAL KESMEN

  4. Tez No

    676563

    Yüksek çözünürlüklü erime eğrilerinin sınıflandırılması için derin öğrenme tabanlı yöntemlerin geliştirilmesi

    Developing deep learning methods to classify high resolution melting curves

    FATMA ÖZGE ÖZKÖK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolErciyes Üniversitesi

    Bilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. METE ÇELİK

  5. Tez No

    352361

    P35S, TNOS and PFMV targeted multiplex PCR using a single dye

    Tek boya kullanarak P35S, TNOS ve PFMV hedefli çoklu PZR

    DENİZ GÜLBİN TAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

    DR. MUSTAFA KOLUKIRIK

Geri Dön