Çeşitli ubiquitin aktive edici E1 enziminlerinin ubiquitin benzeri domainlerinin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve izotopik olarak işaretlenmesi
Clonning, expression, purification and isotopic labeling of ubiquitin-like domains of various ubiquitin activating E1 enzymes
- Tez No: 202901
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. EMİNE SONAY ELGİN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Ubiquitin, Klonlama, Protein Ekspresyonu
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Muğla Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 89
Özet
Ubiquitin 76 aminoasit içeren, yaklasık 8.5kDa ağırlığında olan, evrimsel olarak iyi korunmus, ısıya oldukça dayanıklı bir proteindir. Ubiquitinin diğer proteinlere bağlanması ubiquitilasyon olarak ifade edilir. Ubiquitilasyon translasyon sonrası modifikasyonların en önemlilerinden biridir. Ubiquitilasyon tepkimesi üç enzimi içeren kademeli bir mekanizma seklinde gerçeklesmektedir. Bu enzim kaskatında yer alan ilk enzim ubiquitin aktive edici enzimdir ve ubiquitine ATP varlığında bağlanır, aktive olan ubiquitin diğer enzim olan ubiquitin konjuge edici enzim sayesinde bu enzime bağlanır en son olarak üçüncü enzim ubiquitin ligaz ile de hedef proteine bağlanan ubiquitin 26S proteazom sistemi ile degrade olur. Ubiquitilasyon hücrede, onkogenez, nöral ve kas dejenerasyonu, hücre siklusu, apoptosis vb. hücresel fonksiyonlarda görev almaktadır. Sadece ubiquitin değil ubiquitin benzeri domainleri de hücrede benzer yapısal görevlerde rol almaktadırlar. Bu çalısmada, ubiquitin aktive edici enzimlerin ve ubiquitin benzeri domainlerinin yapılarını belirlemek ve ubiquitilasyon sistemindeki diğer bilesenler ile etkilesimlerini tespit edebilmek amacıyla çesitli E1 enzimlerinin beta-grasp domainlerinin üretilmesi hedeflendi. Bunun amaçla; Uba1, Uba3 ve Ube1L beta-grasp domain genleri modifiye pQE-30 varyantları pQE-308HT ve pQE-30GB1 plazmitlerinin içerisine klonlandı. Klonlanan proteinlerin, bakteriyel sistemde GB1 çözünürlük tagı ile füzyon protein olarak ekspres edilerek üretimi gerçeklestirilip saflastırıldı. NMR çalısmaları için M9 minimal ortamında15N ve 15N ile 13C isaretli protein üretimi gerçeklestirildi. Çözünürlük tagı olan GB1 domainini ayırmak için TEV proteaz enzimi ile kesme reaksiyonu gerçeklestirildi. Çalısmada üretilmesi hedeflenen proteinlerden UbaI ve Ube1L beta-grasp domainlerinin hem 8HT hem de GB1 taglarıyla ekspresyonunda proteinler çözünmez halde ekspres oldu. Çözünür halde proteinleri elde edebilmek için denatüre kosullarda saflastırıldı ama proteinler yine çözünür halde elde edilemedi. Uba3'ün ise kısmen çözünür olarak ekspresyonu gerçeklestirildi ve yapısal çalısmalar için izotopik olarak isaretli protein üretimi gerçeklestirildi.
Özet (Çeviri)
Ubiquitin is a thermal, approximately 8.5kDa weighted protein which includes 76 aa and resistant against heat. Connecting of ubiquitin to the other proteins is defined as ubiquitilation. Ubiquitilation is one of the most important modifications that occurs after the translation. Ubiquitilation reaction is a cascat mechanism with three enzymes. The first enzyme activates the ubiquitin and ties to ubiquitin by means of ATP. Actived ubiquitin is transfered by means of ubiquitin konjuged enzyme and with the helps of third enzyme of ubiquitin ligaz transfered to substrat. Ubiquitilation has a role in oncogenes, neural and muscle degeneration, cell siclus, apoptosis and functions of the cell. Not only the Ubiquitin but also the domains like it has a role in structural functions of the cell. In this study, production of various E1 enzymes beta-grasp domains was aimed in order to identifying the structure of ubiquitin activating enzymes and ubiquitin alike domains also the components and reactions of ubiquitilation system. For this reasons, Uba1, Uba3 and Ube1L beta-grasp domain genes were clonned in modified pQE-30 variations pQE-308HT and pQE- 30GB1 plasmids. Then, clonned proteins, in bacterial system which contains GB1 solubility tag, was produced and purified by expressing as fussion protein. 15N and 15N - 13C included protein were produced in M9 minimal medium for NMR studies. In order to seperate GB1 solubility tag from the protein, TEV protease enzyme was used by means of reaction. The UbaI and Ube1L beta-grasp domains, which were aimed to be produced in this study, were expressed as unsoluable proteins both in expression of 8HT and GB1 tags. However, that were purified in denature conditions to get soluable proteins. Expression of Uba3 resulted in partial solubility. Thus, isotopic labeling protein production was completed for structural studies.
Benzer Tezler
- The ubiquitin/proteasome system related role of Bag-1L in breast cancer
Bag-1L'in ubikuitin/proteazom sisteminde rolünün meme kanserinde incelenmesi
SEVİLAY ACAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- The effect of small molecule modulators of cryptochrome on apoptosis
Kriptokromu modüle eden küçük moleküllerin apoptoz üzerindeki etkisi
BÜŞRA ACAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NURİ ÖZTÜRK
- Telomeraz aktivatör etkili sikloastragenol ve yeni türevlerinin NRF2 ve proteazom sistemlerine etkisi ile yaşlanma karşıtı ve nöroprotektif potansiyellerinin araştırılması
Investigation of anti-aging and neuroprotective potentials of telomerase activator cycloastragenol and its derivatives on NRF2 and proteasome systems
SİNEM YILMAZ
Doktora
Türkçe
2023
BiyokimyaEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. PETEK BALLAR KIRMIZIBAYRAK
- Involvement of autophagy in ochratoxin-a (OTA)-mediated toxicity in HK-2 cell line
HK-2 hücre hattında okratoksin-a güdümlü toksisitede otofajinin katılımı
HİLAL KAHRAMAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. İBRAHİM YAMAN
- VCP/p97 mutant protein is an autophagy target
Otofaji hedefi olan bir VCP/p97 mutantı
ÖZNUR BAYRAKTAR
Doktora
İngilizce
2016
BiyomühendislikSabancı ÜniversitesiBiyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. DEVRİM GÖZÜAÇIK